Status batas sayatan vagina 2.4. Vimentin

25 sitoskeleton, dan ditemukan dalam sel yang secara embrional berasal dari mesenkim dan diekspresikan oleh sel epitel, termasuk sel epitel endometrium. 25 Vimentin diekspresikan oleh tumor yang berasal dari sel mesenkim. Vimentin, protein 57kDa, merupakan salah satu dari protein yang diekspresikan secara luas dan protein yang terpelihara dari famili filament intermediate tipe III. Oleh karena vimentin merupakan komponen sitoskeleton mayor dari sel mesenkimal, vimentin sering digunakan sebagai penanda sel turunan mesenkimal ataupun sel yang mengalami transisi dari epithelial menjadi mesenkimal selama perkembangan normal maupun proses progresi metastatik. 26 Monomer vimentin, seperti filament intermediate lainnya, memiliki gugus pusat α-heliks, ditutup pada setiap ujungnya dengan amino non- helikal kepala dan gugus karboksil ekor. Dua monomer kemungkinan mengekspresikan secara kotranslasi dalam memfasilitasi pembentukan dimer melingkar, yang merupakan subunit dasar penyusunan vimentin. 27,28 Urutan α-heliks berisi pola asam amino hidrofobik yang berkontribusi untuk membentuk hydrophobic seal pada permukaan heliks. Selain itu, terdapat distribusi periodik asam amino asidik dan dasar yang tampaknya memainkan peran penting dalam menstabilkan dimer melingkar. Jarak dari residu optimal untuk jembatan garam ionik, yang memungkinkan untuk stabilisasi strukt ur α-heliks. 27,28 26 Vimentin memainkan peran penting dalam mendukung dan mempertahankan posisi organel dalam sitosol. Vimentin melekat pada inti, retikulum endoplasma, dan mitokondria, baik secara lateral maupun terminal. Sifat dinamis vimentin penting dalam fungsi fleksibilitas untuk sel. Para ilmuwan menemukan bahwa vimentin memberikan daya pegas dari jaringan filamen mikrotubulus atau aktin, ketika berada di bawah tekanan mekanik in vivo. Oleh karena itu, secara umum, diterima bahwa vimentin merupakan komponen sitoskeletal yang bertanggung jawab untuk menjaga integritas sel. Ditemukan bahwa sel-sel tanpa vimentin sangat rentan ketika terganggu dengan mikropunktur. 29,30 Vimentin juga diketahui mengontrol transportasi low-density lipoprotein LDL, dari lisosom ke lokasi esterifikasi. Dengan pemblokiran transportasi kolesterol turunan LDL dalam sel, sel-sel ditemukan menyimpan persentase lipoprotein yang jauh lebih rendah daripada sel normal dengan vimentin. Ketergantungan ini tampaknya menjadi proses pertama dari fungsi biokimia dalam setiap sel yang tergantung pada jaringan filament intermediate selular. 30 Pengaturan unik dari filamen intermediate vimentin pada droplet lipid dalam beberapa tipe sel tertentu menunjukkan kemungkinan bahwa filamen intermediate tipe vimentin memiliki fungsi tertentu yang berhubungan dengan pembentukan droplet lipid pada sel adipogenik. Perubahan dalam pengaturan filamen vimentin yang menyertai konversi adiposa merupakan perubahan yang signifikan dalam pengaturan sitoplasma. Pembentukan kumpulan filamen vimentin pada permukaan 27 droplet lipid, ditutupi oleh endoplasma retikulum cisterna, pertama dijelaskan oleh Franke et al. 1987, terjadi bersamaan dengan peningkatan besar dalam kapasitas pembentukan lipid sel 3T3-L1. Selama adipogenesis, penyusunan filamen sitoskeleton vimentin berubah dari kesatuan fibriliar menjadi satu lapisan filamen intermediate yang dikelilingi globul lipid. 31,32 Sel 3T3-L1 dari morfologi sel adiposit dapat meningkatkan sintesis dan akumulasi trigliserida. Hubungan signifikan secara biologis belum diketahui jelas. 32,33 Vimentin diketahui berperan dalam menjaga integritas seluler dan menyediakan tahanan terhadap stres. Vimentin diekspresikan berlebihan pada beberapa jenis kanker epithelial, termasuk kanker prostat, tumor gastrointestinal, tumor CNS, kanker payudara, melanoma maligna, dan kanker paru. Ekspresi berlebihan Vimentin pada kanker berhubungan dengan percepatan pertumbuhan tumor, invasi, dan prognosis yang buruk. Akan tetapi, kerja Vimentin dalam perkembangan kanker masih tidak jelas. 26,30 Ketika Vimentin diidentifikasi pada tumor epithelial, hal ini akan menunjukkan ekspresi sel terhadap dediferensiasi sel menjadi fenotip yang lebih primitif. Imunoreaktivitas vimentin berlokasi pada sitoplasma sel tumor dan telah dilaporkan menjadi prediktor agresivitas pada karsinoma payudara dan karsinoma ginjal. Imunohistokimia dari filamen intermediate, yang termasuk sitokeratin, vimentin, desmin, glial fibrillary acidic protein, dan neurofilamen, telah digunakan secara luas untuk menggambarkan 28 neoplasma, karena neoplasma cenderung mengekspresikan filament sama dengan jaringan inang. 34

2.5. Imunohistokimia Vimentin

Imunohistokimia Immunohistochemistry IHC adalah sebuah metode pemeriksaan dengan menggunakan prinsip antibodi dengan spesifikasi yang tinggi untuk menunjukkan lokasi dan keberadaan sebuah protein dalam jaringan, yang biasanya dilakukan untuk penelitian, dan tujuan diagnostik atau prognostik. Penilaian IHC diintrepretasikan berdasarkan gabungan antara kualitas ikatan antigen dengan antibodi yang terbentuk di sitoplasma atau inti sel dengan persentase sel yang terwarnai dalam lapang pandang. 35 Diantara metode penilaian IHC tersebut adalah: 1 H score, merupakan penjumlahan dari persentase sel yang terwarnai lemah, persentase sel yang terwarnai sedang dikalikan dengan dua, dan persentase sel yang terwarnai kuat dikalikan dengan tiga. Penilaian ini memberikan skor dari 0-300. 35 2 Allred score, merupakan penjumlahan dari skor persentase sel yang terwarnai 0= tidak terwarnai, 1= terwarnai 1, 2=1-10, 3=10-33, 4=33-67, 5= 67-100 dan skor dari intensitas sel yang terwarnai 0= tidak terwarnai, 1= terwarnai lemah, 2=terwarnai sedang, 3= terwarnai kuat. Penilaian ini akan memberikan skor dari 0-8. 36,37 29 3 Intensitas warna pada sel, merupakan derajat intensitas sel yang terwarnai, dengan nilai: negative - jika tidak ada sel yang terwarnai, + jika sel terwarnai lemah, ++ jika sel terwarnai sedang, dan +++ jika sel terwarnai kuat. 35 Bila digunakan untuk tumor yang diduga berasal dari otot polos, Vimentin dianggap sebagai penanda nonspesifik yang biasa disajikan dalam tumor yang kurang terdiferensiasi dan biasanya berhubungan dengan ekspresi marker lainnya. Hasil positif pewarnaan Vimentin dicirikan dengan sitoplasma sel yang berwarna cokelat. Pada kasus ini sel-sel tumor tersebut menunjukkan hasil negatif atau tidak imunoreaktif terhadap pewarnaan imunohistokimia Vimentin. Hal ini menunjukkan bahwa sel tumor tersebut bukan sel yang berasal dari sel mesenkim. 38 Pewarnaan vimentin diharapkan dapat menjadi indikator prognostik yang lebih baik. Pewarnaan ekspresi vimentin yang dilaporkan pada karsinoma payudara dan karsinoma ginjal, didapati bahwa vimentin yang positif berhubungan dengan prognosis yang buruk. Pada payudara, tumor dengan vimentin positif juga merupakan reseptor estrogen negatif dan memiliki fraksi pertumbuhan Ki67 yang tinggi. Berbeda dengan karsinoma endometrium, tumor dengan vimentin positif berhubungan dengan tumor stadium rendah dan prognosis yang lebih baik. Kurangnya pewarnaan vimentin menandakan perubahan jauh dari fenotip normal endometrium. 39 Berikut gambaran hasil pemeriksaan Vimentin pada adenokarsinoma endometrium: 30 Gambar 2.4. Pewarnaan vimentin pada adenokarsinoma endometrium

2.6 Pemeriksaan Imunohistokimia Vimentin Pada Adenokarsinoma Endometrium dan Serviks

Adenokarsinoma endometrioid serviks menyerupai kasus tipe adenokarsinoma endometrium, namun karsinoma ini berada di serviks. Pembedaan secara histologik antara adenokarsinoma yang berasal dari endometrium dengan yang berasal dari serviks mungkin sulit, terutama pada biopsi kecil atau spesimen kuretase. 6,7 Pemeriksaan imunohistokimia dengan vimentin dapat membedakan kanker endometrium dari kanker endoserviks, khususnya pada gambaran PA yang tumpang tindih. Hal ini disebabkan protein filament intermediate vimentin dapat mengendap dengan baik pada epitel kelenjar endometrium normal maupun yang neoplastik, namun tidak pada epitel kelenjar 31 endoserviks. 8,38 Pengaturan vimentin juga diketahui berhubungan dengan jaringan adiposa. Perubahan dalam pengaturan filamen vimentin yang menyertai konversi adiposa merupakan perubahan yang signifikan dalam pengaturan sitoplasma. 31,32 Jaringan adiposa memiliki enzim aromatase yang aktif. Androgen adrenal dengan cepat dikonversi menjadi estrogen di dalam jaringan adiposa pada individu dengan berat badan berlebih. 14 Tabel 2.3. Perbedaan Adenokarsinoma endometrium dan adenokarsinoma serviks 40 Ketika ditemukan pada tumor epithelial, hal ini menunjukkan ekspresi dediferensiasi sel pada fenotipe yang lebih primitif. Imunoreaktivitas Vimentin yang terbatas pada sitoplasma sel tumor dilaporkan sebagai prediktor agresivitas pada kanker payudara dan ginjal. Dalam proses pembelajaran jaringan ginekologis dengan antibodi pada 32 filamen intermediate, diketahui bahwa vimentin diekspresikan secara luas oleh kelenjar normal endometrium proliferatif, tetapi tidak pada kelenjar endometrium sekretori. Pada endometrium proliferatif normal, ko-ekspresi sitokeratin dan vimentin membentuk tatanan fenotipikal normal, dan terdapatnya ekspresi vimentin pada kanker endometrium menunjukkan fenotipe yang kurang maligna. Semakin sedikit vimentin yang diekspresikan menunjukkan diferensiasi kanker endometrium yang lebih buruk. 34 Pola pemeriksaan imunohistokimia memungkinkan identifikasi asal jaringan yang lebih akurat dibandingkan dengan pemeriksaan hematoksilin-eosin saja. Pemeriksaan imunohistokimia yang dapat membedakan adenokarsinoma endometrium dan adenokarsinoma endoserviks adalah vimentin, ProExC, carcinoembrionic antigen CEA, reseptor estrogen ER, dan p16. Terdapat beberapa penelitian yang menilai kemampuan pemeriksaan imunohistokimia dengan vimentin dalam membedakan adenokarsinoma endometrium dari adenokarsinoma endoserviks dengan hasil nilai sensitivitas dan spesifisitas yang sangat tinggi mencapai hingga 97. 8 Pada penelitian Amru Sofian, dkk pada tahun 2006 meneliti peran pemeriksaan imunohistokimia Vimentin sebagai penanda asal jaringan kanker endometrium. Dari hasil penelitian diperoleh hasil bahwa pemeriksaan imunohistokimia vimentin mampu membedakan asal jaringan kanker. Karsinoma endometrium dengan metode pemeriksaan ini memiliki sensitivitas 93,7 dan spesifisitas 94,4 dalam mengenali 33 jaringan endometrium. Semakin rendah persentase area Vimentin, semakin tinggi stadium surgikalnya p= 0,194 dan semakin rendah persentase area Vimentin, semakin buruk derajat diferensiasi sel kanker p=0,12. 9 Penelitian Domenico Coppola, dkk didapatkan hasil imunoekspresi Vimentin ditemukan pada 35 kanker endometrium. Hal ini terdapat pada 90 kanker stadium rendah tetapi hanya pada 17 kanker stadium tinggi. Ekspresi ini tidak tampak pada pasien yang meninggal karena penyakit dan diekspresikan pada pasien-pasien yang hidup tanpa bukti penyakit 67. Oleh karena itu, Vimentin positif secara keseluruhan berhubungan dengan tumor stadium rendah p0,001 dan prognosis yang lebih baik p0,05. 39 Penelitian Kamoi membandingkan pewarnaan imunohistokimia dalam membedakan adenokarsinoma primer pada endometrium dan endoserviks. Pola pewarnaan imunohistokimia yang dapat mengidentifikasi daerah asal yang lebih akurat daripada pewarnaan hematoksilin eosin sendiri adalah kombinasi imunohistokimia Vimentin dan skor ER pada karsinoma endometrioid, mendapatkan hasil akurasi 95 pada asal tumor dari endometrium. 41 Castrillon dkk juga meneliti pewarnaan imunohistokimia dalam membedakan adenokarsinoma endometrial dan endoserviks dengan membandingkan imunohistokimia Vimentin Vim, carcinoembryonic antigen CEA, epithelial membrane antigen EMA, dan cytokeratin 7 dan 34 20 CK7 dan CK20. Disimpulkan bahwa Vim dan CEA merupakan marker imunohistokimia yang berguna dalam membedakan adenokarsinoma endometrium dan endoserviks, namun CK7, CK20, dan EMA tidak berguna dalam membedakannya. 42

2.7. Hipotesis Penelitian

Hipotesis pada penelitian ini adalah: Pemeriksaan ekspresi Vimentin spesifik terhadap adenokarsinoma endometrium.

2.8. Kerangka Teori

Aromatase Mutasi PTEN Hiperplasia Endometrium Vimentin Endometrium Normal Penyakit Metabolik Unopposed estrogen Mutasi PI3KCA Mutasi β-catenin Adenokarsinoma Endometrium Mutasi K-ras Protoonkogen Onkoprotein HPV E6 dan E7 Displasia sel epitel serviks Mutasi gen suppressor tumor p53 dan pRb Aktivitas proliferasi ↑ Apoptosis ↓ Adenokarsinoma serviks Jaringan Adipose 35

2.9. Kerangka Konsep

Vimentin Adenokarsinoma endometrium Adenokarsinoma serviks 36

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini merupakan penelitian uji diagnostik dengan luaran sensitivitas dan spesifisitas pemeriksaan imunohistokimia vimentin terhadap blok parafin jaringan adenokarsinoma endometrium dan adenokarsinoma serviks.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat penelitian dilakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi RSUP H. Adam Malik Medan dan RSUD dr. Pirngadi Medan. Pemeriksaan imunohistokimia vimentin dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RS Murni Teguh Medan. Waktu penelitian dimulai pada Januari 2015 hingga jumlah sampel terpenuhi.

3.3. Subyek Penelitian

Subyek penelitian adalah penderita kanker endometrium dan kanker serviks dimana akan digunakan sediaan blok parafin jaringannya pasca pembedahan histerektomi total ataupun radikal histerektomi, kuretase dan biopsi di Departemen Obstetri dan Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medan dan RSUD dr. Pirngadi Medan. 37

3.4. Sampel Penelitian

a. Jumlah sampel penelitian uji diagnostik dihitung berdasarkan rumus penentuan besar sampel untuk uji diagnostik. 43 n = Zα 2 Sen 1-Sen d 2 P = 1,96 2 0,95 x 0,05 0,10 2 x 0,31 = 3,8416 x 0,0475 0,01 x 0,31 = 58,86 ≈ 59 Keterangan: n = jumlah sampel α = tingkat kesalahan ditetapkan sebesar 5 Zα=1,96 Sen = sensitivitas yang diinginkan, ditetapkan sebesar 95 d = presisi penelitian ditetapkan sebesar 10 P = prevalensi kanker endometrium = 31 Prevalensi kanker endometrium diambil dari kepustakaan. 2 b. Untuk mengetahui korelasi antara penilaian pewarnaan vimentin dengan diferensiasi adenokarsinoma endometrium, jumlah sampel penelitian dihitung berdasarkan rumus penentuan besar sampel untuk uji korelasi. 43 38 2 = 1,96 + 0,842 + 3 0,5 ln 1+0,5 1-0,5 = 27 Keterangan : n : Jumlah sampel yang akan diperiksa α : Kesalahan tipe I 0,05 Z α : 1,96 β : Kesalahan tipe II 0,2 Z β : 0,842 r : Perkiraan koefisien korelasi sedang dengan nilai 0,5 Berdasarkan perhitungan di atas besar sampel minimal untuk penelitian ini adalah 59 sampel. 39

3.5. Variabel Penelitian

1. Adenokarsinoma endometrium 2. Adenokarsinoma serviks 3. Vimentin

3.6. Kriteria Inklusi dan Eksklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah: 1. Blok parafin jaringan adenokarsinoma endometrium dan adenokarsinoma serviks yang dibuktikan dengan hasil pemeriksaan histopatologi. 2. Data rekam medis lengkap Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah: Sediaan blok parafin tidak dapat dilabel dan dianalisa pada pewarnaan vimentin.

3.7. Cara kerja dan teknik pengumpulan data

 Setelah mendapat persetujuan dari komisi etik untuk melakukan penelitian, penelitian dimulai dengan mengumpulkan data pasien dengan hasil histopatologi adenokarsinoma endometrium dan adenokarsinoma serviks dari pembedahan berupa operasi, kuretase dan biopsi.  Dilakukan pengumpulan blok parafin . 40  Pasien diseleksi berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi dan dicari data rekam medis pasien tersebut.  Pada blok parafin dilakukan pemeriksaan imunohistokimia vimentin. Pemeriksaan imunohistokimia adalah pemeriksaan jaringan yang telah dilabel dengan antibodi spesifik untuk melihat ekspresi protein antigen spesifik dengan mikroskop.  Pembacaan hasil pemeriksaan imunohistokimia dilakukan oleh dua dokter spesialis Patologi Anatomi.  Hasil interpretasi sediaan tersebut dilakukan analisis statistik. 3.8 Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia 3.8.1 Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, incubator, staining jar, rak object glass, pipet mikro, kertas saring, tabung sentrifuge 15ml, coated object glass, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya,Microwave Samsung R Triple Distribution System, Korea , mikroskop. Bahan-bahan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah xylene, alkohol absolut 70, alkohol absolut 80, akuades, target retrieval solution TRS, wash buffer WB, Dako FLEX tm peroxidase,Dako FLEX tm Diamino Benzidine DAB, phosphate buffer saline PBS, hematoxylin, mounting medium, Antibodi primer : Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone V9. 41

3.8.2 Cara kerja

- Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4µm dan ditempelkan pada coated object glass. - Warnai dengan metode imunohistokimia dengan tahap sebagai berikut 1. Deparaffinizing and rehidrasi 2. Penerimaan antigen 3. Pewarnaan immunohistokimia antibody primer 4. Counterstaining 5. Dehidrasi and stabilisasi dengan mounting medium 6. Melihat pewarnaan di bawah mikroskop Tabel 3.1. Tahapan Pewarnaan Vimentin Panaskan slide hasil potongan microtome pada hotplate suhu 60 C 60 menit Xylene 2 kali 10 menit Rehidrasi Alkohol absolut, 80, 70 15 menit Bilas dengan air mengalir keran 5 menit Akuades 5 menit Masukkan slide ke dalam TRS yang sudah dihangatkan Masukkan ke dalam Microwave Samsung TDS dengan kondisi sbb: 800 Watt 3 menit 100 Watt 20 menit 42 Dinginkan slide 20 menit Bilas dengan Wash Buffer WBPBS-T2 kali 10 menit Blocking dengan Dako FLEX Peroxidase 5 menit Bilas dengan Wash Buffer WBPBS-T 2 kali 10 menit Antibodi primer : Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone V9 60 menit Bilas dengan Wash Buffer WBPBS-T 2 kali 10 menit Dako FLEX HRP 20 menit Bilas dengan Wash Buffer WBPBS-T 2 kali 10 menit Dako FLEX DAB + SUBSTRAT 5 menit Bilas dengan PBS-T 2 kali 10 menit Hematoxylin 2 menit Bilas dengan air mengalir keran 5 menit Dehidrasi alcohol 70, 80, absolut 15 menit Xylene 2 kali 10 menit Mounting medium dan coverslip Pengamatan di bawah mikroskop 310 menit

3.8.3. Instrumen Penilaian

Penilaian imunuhistokimia vimentin menggunakan skor Allred. Skor ini adalah hasil penjumlahan skor persentase dari sel yang terwarnaiproportion score PS dan skor intensitas pewarnaannya Intensity score IS. 33,34