pengujian sifat antidiare dan antioksidatif dari yogurt sinbiotik formula terbaik secara in vivo terdiri atas tahap pemberian perlakuan terhadap hewan percobaan, pengamatan penampakan feses, analisis
kadar air feses, pengamatan penampakan anus, pengukuran kenaikan berat badan, serta analisis kandungan enzim superoksida dismutase SOD pada jaringan hati dan ginjal dari hewan percobaan.
3.2.1 Penentuan Formula Yogurt Sinbiotik Terbaik
Parameter yang digunakan untuk menentukan formula yogurt terbaik adalah aktivitas antimikroba dari setiap formula yogurt terhadap bakteri enteropathogenic Escherichia coli EPEC,
tekstur, dan pH yogurt.
3.2.1.1 Pembiakan Kultur Starter Bakteri Asam Laktat
Pembuatan yogurt sinbiotik ini diawali dengan pembiakan kultur yogurt yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus serta bakteri Lactobacillus plantarum 2C12 dan
Lactobacillus fermentum 2B4. Pertama, kultur murni disegarkan terlebih dahulu pada media de Man Rogosa Sharpe Broth MRSB. Kemudian, sebanyak 2 dari kultur yang disegarkan tersebut
diinokulasikan ke dalam larutan susu skim steril 10. Setelah itu, kultur tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur hasil inkubasi ini disebut dengan kultur induk.
Sebanyak 2 dari kultur induk diinokulasikan ke dalam larutan susu skim 10 yang telah mengandung glukosa murni 2 dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan hasilnya disebut
dengan kultur kerja. Setelah itu, kultur kerja dipupukkan pada media de Man Rogosa Sharpe Agar MRSA untuk mengetahui populasinya. Kultur yang memenuhi syarat untuk siap dijadikan kultur
starter yogurt adalah kultur dengan jumlah populasi minimum 10
7
cfug CAC 2003.
3.2.1.2 Pemeliharaan Kultur Stok Hidayat 2009
Kultur stok yang telah dibuat perlu diperbaharui agar aktivitasnya tidak berkurang. Kultur stok yang disimpan terlalu lama lebih dari satu minggu, dapat berkurang aktivitasnya karena
habisnya substrat dan menumpuknya metabolit. Pemeliharaan kultur stok pada penelitian ini diawali dengan melakukan penusukan kultur pada media MRSA chalk semi solid, kemudian tusukan tersebut
diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 hari. Setelah itu, kultur yang telah diinkubasi tersebut dapat disimpan di lemari pendingin sebagai kultur stok dan dapat bertahan selama beberapa bulan.
Kultur stok tersebut dapat digunakan dalam pembuatan yogurt. Kultur stok disegarkan terlebih dahulu ke dalam media MRSB dengan pengambilan kultur sebanyak satu lup untuk
menumbuhkannya kembali. Lalu, kultur tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama satu hari sehingga menjadi kultur segar. Kemudian, kultur tersebut dapat disimpan di refrigerator atau
diperlakukan seperti kultur segar pada tahap pembiakan kultur starter untuk membuat yogurt.
3.2.1.3 Pembuatan Formula Yogurt
Empat formula yogurt yang dibuat adalah: 1
Formula 1 F1: L. bulgaricus + S. thermophilus 2
Formula 2 F2: L. bulgaricus + S. thermophilus + L. plantarum 2C12
18
3 Formula 3 F3: L. bulgaricus + S. thermophilus + L. fermentum 2B4
4 Formula 4 F4: L. bulgaricus + S. thermophilus + L. plantarum 2C12 + L. fermentum 2B4
Proses pembuatan yogurt diawali dengan melarutkan 5 gula pasir, 5 FOS sebagai prebiotik, dan susu skim agar total padatan yogurt menjadi 22. Hal ini karena total padatan, yaitu
padatan susu maupun pemanis dengan konsentrasi lebih dari 22 akan menghambat aktivitas L. bulgaricus Rahman et al. 1992. Setelah itu, campuran bahan dipanaskan pada suhu 85°C selama
30 menit Rahman et al. 1992, kemudian didinginkan hingga suhu 37°C. Lalu, dilakukan penambahan starter 2 sesuai dengan formula yang telah ditentukan, kemudian diaduk hingga
merata. Selanjutnya, inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah itu, untuk menjaga mutu yogurt tersebut, yogurt dapat disimpan dingin pada suhu 5-6°C. Pembuatan formula yogurt dilakukan
dengan empat ulangan.
3.2.1.4 Pembiakan Kultur Enteropathogenic Escherichia coli EPEC
Kultur bakteri uji enteropathogenic Escherichia coli atau EPEC dalam media Nutrient Agar NA berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth NB dan diinkubasi pada suhu
37°C selama 24 jam. Kultur segar siap digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri dari yogurt sinbiotik.
Untuk mengetahui jumlah bakteri EPEC awal 1, dilakukan pemupukan pada media EMBA Eosin Methylene Blue Agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam. Setelah
inkubasi, jumlah bakteri koloni EPEC awal dihitung berdasarkan metode BAM 2001.
3.2.1.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri dari Yogurt Sinbiotik Davidson et al.
2005
Pengujian aktivitas antibakteri EPEC dari yogurt dilakukan dengan metode kontak yaitu dengan melihat penurunan jumlah bakteri EPEC akibat aktivitas yogurt. Metode kontak adalah
sebagai berikut. Bakteri EPEC sebanyak 0.1 ml 1 dikontakkan dengan masing-masing formula yogurt sebanyak 10 ml selama 2, 4, dan 6 jam. Penentuan lama waktu kontak tersebut didasarkan
pada kurva pertumbuhan EPEC di mana waktu antara 2 hingga 6 jam merupakan waktu fase logaritma bakteri E. coli Quigley 2008. Kurva pertumbuhan bakteri E. coli Quigley 2008 dilampirkan pada
Lampiran 2. Setelah dikontakkan, dilakukan pemupukan pada media EMBA, kemudian diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 48 jam agar dapat menghitung jumlah bakteri EPEC di akhir waktu kontak. Setelah inkubasi, jumlah bakteri koloni EPEC di akhir masing-masing waktu kontak dihitung berdasarkan
metode BAM 2001. Kemudian, jumlah penurunan bakteri EPEC dihitung dengan mengurangi jumlah bakteri EPEC awal dengan jumlah bakteri EPEC di akhir waktu kontak.
Jumlah penurunan EPEC = jumlah EPEC awal – jumlah EPEC di akhir waktu kontak
Keterangan: = semua dalam satuan log cfuml Jumlah EPEC awal = jumlah bakteri EPEC sebelum dikontakkan dengan yogurt
Jumlah EPEC akhir = jumlah EPEC akhir setelah dikontakkan dengan yogurt selama 2, 4, atau 6 jam
19
3.2.1.6 Pengamatan Tekstur dari Yogurt Sinbiotik
