antimikroba Collado et al. 2007. Namun, berdasarkan hasil penelitian, diperoleh bahwa kadar air feses tikus kelompok kontrol positif ini ternyata menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata
p 0.05 dengan kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC. Hal ini kemungkinan karena diare yang dialami oleh tikus tersebut adalah diare ringan.
Menurut Muscari 2001, berdasarkan tingkat keparahannya, diare dikelompokkan menjadi diare ringan, diare sedang, dan diare berat. Diare ringan ditandai dengan karakteristik sedikit
pengeluaran feses yang encer, tanpa gejala lain. Diare sedang dicirikan dengan karakteristik pengeluaran feses cair atau encer beberapa kali dan terjadi penurunan berat badan. Sementara itu,
diare berat ditandai dengan karakteristik pengeluaran feses yang banyak dan terlihat gejala dehidrasi sedang sampai berat. Karena tikus kelompok kontrol positif menunjukkan sedikit pengeluaran feses
yang encer, tikus kelompok ini tergolong mengalami diare ringan. Dengan demikian, kadar airnya tikus kelompok kontrol positif tidak berbeda nyata dengan tikus kelompok yang diberi yogurt
sinbiotik dan intervensi EPEC.
4.2.3 Kenaikan Berat Badan Tikus Percobaan
Hasil pengukuran kenaikan berat badan tikus percobaan dan hasil uji statistika Anova dan Duncan kenaikan berat badan dari masing-masing kelompok tikus percobaan dapat dilihat pada
Lampiran 14, 15, dan 16. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa kenaikan berat badan tikus percobaan berkisar antara 6.04 hingga 7.83 gram. Kenaikan berat badan tertinggi terdapat pada tikus
kelompok yang diberi yogurt sinbiotik 7.83 g, namun nilainya tidak berbeda nyata p 0.05 dengan semua perlakuan. Hasil ini menunjukkan bahwa infeksi EPEC yang diberikan tidak sampai
menyebabkan penurunan berat badan pada tikus percobaan. Tidak terjadinya penurunan berat badan tersebut sesuai dengan penelitian Hartanti 2010
yang menyatakan bahwa tikus percobaan masih mengalami peningkatan berat badan selama pengujian diare akibat EPEC. Hal tersebut mungkin terjadi karena diare yang dialami tikus memang tidak
sampai menyebabkan tikus kekurangan cairan terlalu banyak, tetapi hanya menyebabkan feses lembek, berukuran lebih besar, dan berwarna lebih pucat Hartanti 2010.
4.2.4 Kandungan Enzim Superoksida Dismutase SOD pada Jaringan Hati
Berdasarkan pewarnaan imunohistokimia teradap enzim SOD pada jaringan hati, diperoleh fotomikrograf dan hasil perhitungan inti sel hati. Contoh hasil dari pewarnaan imunohistokimia dari
jaringan hati tikus dapat dilihat pada Gambar 8. Pengamatan kualitatif terhadap jaringan hati pada terminasi hari ke-8 Lampiran 17
menunjukkan bahwa semua kelompok tikus memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang relatif sama. Kemudian pada terminasi hari ke-15, pengamatan kualitatif Lampiran 18 menunjukkan bahwa tikus
kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan kontrol positif memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif, sementara tikus kelompok yang diberi
yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Lalu pada terminasi hari ke-22, pengamatan
kualitatif Lampiran 19 menunjukkan bahwa tikus kelompok kontrol negatif dan kelompok yang diberi yogurt sinbiotik memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang lebih tinggi dibandingkan dengan
kelompok lainnya, sedangkan tikus kelompok kontrol positif memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang paling rendah. Selain itu, pengamatan kualitatif pada terminasi hari ke-22 juga memperlihatkan
31
bahwa tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok yang diberi yogurt standar.
Keterangan: e.
+++ = positif kuat warna coklat tua f.
++ = positif sedang warna coklat sedang g.
+ = positif lemah warna coklat yang bercampur dengan biru h.
- = negatif warna biru
Gambar 8. Fotomikrograf jaringan hati tikus Untuk memperjelas pengamatan kualitatif di atas, dilakukan pengamatan kuantitatif terhadap
inti sel hati. Hasil perhitungan inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-8, 15, dan 21 disajikan pada Tabel 6, sedangkan hasil uji Anova dan diagram batang persentase jumlah inti sel hati tikus yang
mengandung SOD dan yang tidak mengandung SOD pada Lampiran 20-32. Terminasi hari ke-8 menunjukkan bahwa secara statistika, tikus kelompok kontrol negatif,
kelompok yang diberi yogurt sinbiotik, kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC, serta kelompok kontrol positif memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang relatif sama. Hal ini terlihat
dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif sedang dan lemah dari keempat kelompok tikus tersebut tidak berbeda nyata p 0.05. Tikus kelompok yogurt sinbiotik serta tikus kelompok yogurt
sinbiotik + EPEC, yang mendapatkan perlakuan yogurt saja pada hari ke-1 sampai hari ke-7, menunjukkan kandungan Cu, Zn-SOD yang tidak berbeda nyata dibandingkan dengan tikus kelompok
kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini berarti bahwa yogurt sinbiotik mampu mempertahankan kondisi tubuh tetap normal sehat.
Terminasi hari ke-15 menunjukkan bahwa tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang paling tinggi dibandingkan dengan tikus kelompok lainnya.
Hal ini terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif sedang paling tinggi secara sangat nyata p 0.01 pada tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dibandingkan dengan kelompok lainnya.
Dengan demikian, yogurt sinbiotik dapat meningkatkan kandungan Cu, Zn-SOD dalam jaringan hati.
32
Tabel 6. Rata-rata jumlah inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu, Zn-SOD pada jaringan hati tikus pada terminasi hari ke-8, 15, dan 22 per bidang pandang dengan perbesaran 200×
Terminasi Hari ke-8 Jumlah Inti Sel Hati Tikus
+++ ++ + -
Baseline 36.00 ± 6.24
a,b
39.33 ± 3.06
a
20.00 ± 2.64
a
25.00 ± 3.60
c
Kontrol negatif 48.67 ± 2.08
d
43.00 ± 5.00
a,b
22.33 ± 3.21
a
21.33 ± 2.08
b,c
Yogurt sinbiotik 46.33 ± 2.89
c,d
48.67 ± 4.04
b
18.67 ± 2.52
a
24.67 ± 3.06
b,c
Yogurt sinbiotik + EPEC 40.67 ± 3.51
b,c
41.00 ± 4.58
a
27.00 ± 1.00
a
14.00 ± 3.60
a
Kontrol positif 32.67 ± 2.08
a
37.67 ± 3.06
a
28.33 ± 6.81
a
18.00 ± 3.60
a,b
Terminasi Hari ke-15
Kontrol negatif 43.33 ± 5.13
a
36.67 ± 1.53
a
22.67 ± 1.53
b
33.00 ± 5.29
b
Yogurt sinbiotik 63.00 ± 3.60
b
46.33 ± 3.51
b
15.00 ± 1.73
a
13.33 ± 5.13
a
Yogurt sinbiotik + EPEC 32.67 ± 1.53
a
35.33 ± 1.15
a
14.00 ± 2.00
a
48.33 ± 2.52
c
Kontrol positif 59.67 ± 7.23
b
36.67 ± 1.53
a
12.33 ± 3.78
a
23.33 ± 6.81
a,b
Terminasi Hari ke-22
Kontrol negatif 43.00 ± 4.36
a,b
45.67 ± 5.86
b
34.67 ± 2.52
c
17.67 ± 2.08
a
Yogurt sinbiotik 66.00 ± 5.20
c
43.00 ± 1.00
b
15.33 ± 5.13
a,b
18.67 ± 5.69
a
Yogurt sinbiotik + EPEC 43.67 ± 1.53
a,b
36.00 ± 2.00
b
18.67 ± 1.53
b
21.33 ± 5.03
a
Kontrol positif 36.67 ± 1.53
a
26.33 ± 8.14
a
11.33 ± 3.78
a
41.00 ± 2.00
c
Yogurt standar 48.00 ± 5.29
b
37.33 ± 1.53
b
12.67 ± 3.06
a,b
33.67 ± 3.06
b
Keterangan:
•
Uji statistika Anova dan Duncan dilakukan dalam setiap kolom tabel dan waktu terminasi yang sama
•
Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata p 0.05 Lampiran 20-31
Menurut Songisepp et al. 2004, L. fermentum ME-3 memiliki potensi antioksidatif yang tinggi. L. fermentum ME-3 sebagai probiotik dengan aktivitas antimikroba dan antioksidatif
bermanfaat untuk memperbaiki status stres oksidatif organisme yang mengonsumsinya dan mengurangi risiko infeksi Mikelsaar dan Zilmer 2009. Oleh karena itu, yogurt sinbiotik, yang
mengandung L. fermentum 2B4, mampu meningkatkan kandungan enzim Cu, Zn-SOD pada jaringan hati tikus.
Selain itu, terminasi hari ke-15 juga menunjukkan bahwa tikus kelompok kontrol positif, yang mendapatkan perlakuan intervensi EPEC, memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang tinggi pula.
Hal ini terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat pada tikus kelompok kontrol positif 59.67 yang tidak berbeda nyata p 0.05 dengan tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik
63.00. Kandungan Cu, Zn-SOD dari tikus kelompok kontrol positif tinggi karena EPEC yang baru
diinfeksi selama seminggu dapat memicu produksi enzim Cu, Zn-SOD. Hasil seperti ini mungkin terjadi seperti yang dikatakan oleh Halliwell dan Gutteridge 1999 bahwa paparan organisme oleh
stres oksidatif yang ringan dapat menyebabkan peningkatan sintesis sistem pertahanan antioksidan dengan cepat. Respon seperti ini membantu melindungi sel terhadap stres oksidatif dan terhadap
serangan radikal yang lebih besar pada waktu berikutnya sehingga sel menjadi resisten terhadap keberadaan radikal bebas yang lebih tinggi. Mekanisme adaptasi ini umumnya melibatkan perubahan
33
dalam ekspresi gen yang menyebabkan peningkatan pertahanan antioksidan Halliwell dan Gutteridge 1999.
Peningkatan enzim antioksidan Cu, Zn-SOD seperti itu mungkin terjadi seperti yang disebutkan oleh Li et al. 2010 bahwa setelah diinjeksi dengan patogen, acute virus necrobiotic virus
AVNV, kandungan acid phosphatase ACP, SOD, dan katalase dalam hemocytes dari kerang Chlamys farreri secara nyata lebih tinggi dari kontrol, tetapi kemudian turun hingga level normal. Li
et al. 2010 menyebutkan pula bahwa aktivitas SOD juga mengalami peningkatan secara nyata dalam hemocytes setelah kerang Chlamys farreri diinfeksi oleh E. coli.
Tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC pada terminasi hari ke-15 menunjukkan kandungan Cu, Zn-SOD yang lebih rendah dibandingkan dengan tikus kelompok yang
diberi yogurt sinbiotik. Hal ini terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat dan sedang pada tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC lebih rendah secara sangat
nyata p 0.01 dibandingkan dengan tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik. Hal ini ditunjukkan pula oleh jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif pada tikus kelompok yang diberi
yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC yang lebih tinggi secara sangat nyata p 0.01 dibandingkan dengan tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik.
Tikus kelompok yogurt sinbiotik + EPEC, selain mendapat perlakuan yogurt sinbiotik, juga mendapat intervensi EPEC. Bakteri yang menginfeksi tubuh dapat sampai pada saluran pencernaan
manusia. Sementara itu, hati menerima suplai darah dari beberapa sumber yang berbeda, seperti dari lambung, usus halus, usus besar, pankreas, dan limpa. Darah tersebut mengandung zat-zat gizi dan
mungkin juga mengandung bakteri usus, racun, serta obat yang dicerna Corwin 2007. Oleh karena itu, infeksi bakteri dapat mempengaruhi kondisi hati.
Diketahui bahwa mekanisme pertahanan inang terhadap infeksi bakteri adalah melalui aktivasi sel-sel fagosit, seperti makrofag dan sel-sel PMN polimorfonuklear, di mana molekul toksik
yang dapat melawan bakteri tersebut adalah ROS reactive oxygen species. Reactive oxygen species ROS, seperti radikal superoksida berperan dalam mekanisme pertahanan seluler, termasuk dalam
aksi bakterisidal dari makrofag dan polimorfonuklear. Walaupun demikian, ROS tersebut juga dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada berbagai penyakit inflamatori. Namun, kerusakan oksidatif
tersebut dapat dicegah dengan antioksidan dan beberapa enzim, seperti SOD. Hal ini menunjukkan bahwa molekul-molekul ROS yang dikeluarkan oleh sel-sel fagosit pada tubuh yang terinfeksi
bertanggung jawab terhadap patogenesis Umezawa et al. 1995. Radikal superoksida adalah salah satu produk yang dihasilkan oleh sel-sel fagosit untuk
membunuh bakteri yang menginfeksi tubuh inang. Dengan demikian, infeksi EPEC dapat menyebabkan peningkatan radikal superoksida sehingga enzim Cu, Zn-SOD yang perlu dikeluarkan
untuk menetralkan radikal tersebut lebih banyak. Oleh karena itu, kandungan Cu, Zn-SOD pada tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC relatif lebih rendah.
Seperti terminasi hari ke-15, terminasi hari ke-22 juga menunjukkan bahwa tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang paling tinggi dibandingkan
dengan kelompok lainnya. Hal ini terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat dengan jumlah yang paling tinggi secara sangat nyata p 0.01. Hasil ini menunjukkan bahwa yogurt
sinbiotik masih dapat memberikan manfaat positifnya selama tiga minggu konsumsi. Terminasi hari ke-22 juga menunjukkan bahwa tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik
dan intervensi EPEC memiliki kandungan Cu, Zn-SOD yang relatif sama dengan tikus kelompok kontrol negatif. Hal ini terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat dan sedang pada
tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik dan intervensi EPEC tidak berbeda nyata p 0.05
34
dengan tikus kelompok kontrol negatif. Hal ini ditunjukkan pula oleh jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif yang tidak berbeda nyata pula pada kedua kelompok tersebut.
Tikus kelompok kontrol positif menunjukkan kandungan Cu, Zn-SOD yang paling rendah pada terminasi hari ke-22. Hal ini ditunjukkan oleh jumlah inti sel hati yang bereaksi positif sedang
yang paling rendah dan jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif paling tinggi secara nyata p 0.05 dibandingkan dengan kelompok lainnya.
Hartanti 2010 menyatakan bahwa probiotik mampu menstimulasi sistem imun dengan meningkatkan fungsi fagositosis dari monosit. Menurut Baratawidjaja 2006, monosit tidak hanya
menyerang mikroba, tetapi juga memproduksi sitokin IL-6 dan TNF- α dan mengerahkan pertahanan
sebagai respon terhadap infeksi. IL-6 interleukin-6 dan TNF- α tumor necrosis factor-α dapat
memodulasi produksi tembaga Cu dan seng Zn. Tersedianya Cu dan Zn tersebut berperan untuk pembentukan atau pengaktivan enzim Cu, Zn-SOD karena Cu, Zn-SOD membutuhkan Cu dan Zn
untuk melakukan aktivitas biologisnya Li et al. 2010. Dengan demikian Cu, Zn-SOD yang terbentuk akan semakin banyak. Mekanisme inilah yang kemungkinan dilakukan oleh probiotik untuk
dapat meningkatkan kandungan enzim Cu, Zn-SOD. Dengan demikian, pemberian yogurt sinbiotik memberikan manfaat yang lebih baik terhadap infeksi EPEC dibandingkan tanpa pemberian yogurt
sinbiotik. Selain itu, yogurt sinbiotik juga dapat memulihkan kondisi tubuh akibat infeksi bakteri. Berdasarkan terminasi hari ke-22 pula, ditemukan bahwa yogurt sinbiotik memiliki efek yang
lebih baik pada jaringan hati dibandingkan dengan yogurt standar. Hal ini ditunjukkan oleh jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat pada tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik lebih tinggi
secara sangat nyata p 0.01 dibandingkan dengan kelompok yang diberi yogurt standar. Hal ini terlihat pula dari jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif pada tikus kelompok yang diberi yogurt
sinbiotik lebih rendah secara sangat nyata p 0.01 dibandingkan dengan kelompok yang diberi yogurt standar.
Yogurt sinbiotik menunjukkan manfaat yang lebih baik dibandingkan dengan yogurt standar karena yogurt sinbiotik mengandung probiotik. Beberapa komponen antioksidatif, yang berhubungan
dengan sistem pertahanan antioksidan manusia, berasal dari bahan makanan danatau dari mikroflora saluran pencernaan Mikelsaar dan Zilmer 2009. Menurut Langen dan Madsen 2010, probiotik
memiliki manfaat ganda, yaitu memodulasi mikroflora usus serta menurunkan stres oksidatif dan inflamasi pada hepatosit. Modulasi mikroflora usus dapat menyebabkan penurunan kandungan
amonia dalam tubuh. Hal ini dapat terjadi dengan mengurangi permeabilitas usus dan sekresi urease oleh bakteri, meningkatkan ekskresi amonia, dan memperbaiki status nutrisi penyerapan dari sel-sel
epitelial saluran pencernaan. Penurunan stres oksidatif dan inflamasi menyebabkan meningkatnya fungsi dan kapasitas hati untuk menetralkan dan menurunkan penyerapan toksin dan amonia.
Berdasarkan hasil terminasi hari ke-8, hari ke-15, dan hari ke-22, tikus kelompok yang diberi yogurt sinbiotik menunjukkan peningkatan jumlah inti sel hati yang bereaksi positif kuat. Hal ini
memperlihatkan bahwa pemberian yogurt sinbiotik dapat meningkatkan kandungan enzim Cu, Zn- SOD, sesuai dengan pernyataan Zubillaga et al. 2001 yang menyebutkan bahwa pangan fungsional
yang mengandung probiotik dapat meningkatkan ekspresi superoksida dismutase. Selain itu, ditemukan pula bahwa tikus kelompok kontrol positif memiliki kandungan
Cu, Zn-SOD yang tetap tinggi pada terminasi hari ke-15 setelah mengalami intervensi EPEC, namun kemudian mengalami penurunan pada terminasi hari ke-22. Hasil demikian mungkin terjadi karena
EPEC yang diinfeksi hanya memicu produksi enzim Cu, Zn-SOD pada awalnya seperti ditunjukkan ketika terminasi hari ke-15, tetapi tidak dapat mempertahankan kandungan Cu, Zn-SOD berikutnya.
Seperti yang telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan kandungan Cu, Zn-SOD pada terminasi hari ke-15 ini disebabkan oleh adanya mekanisme adaptasi yang melibatkan perubahan dalam ekspresi
35
gen yang menyebabkan peningkatan pertahanan antioksidan. Proses adaptasi ini merupakan proses yang time-dependent Plaks et al. 2004. Aktivasi ekstensif dari sel-sel fagosit, yang menghasilkan
ROS, dapat memperparah kerusakan jaringan dan inflamasi Halliwell dan Gutteridge 1999. Oleh karena itu, semakin banyak enzim Cu, Zn-SOD yang perlu dikeluarkan untuk menangkap ROS
tersebut sehingga kandungannya di dalam jaringan hati menjadi menurun. Kemudian, tikus kelompok yogurt sinbiotik + EPEC menunjukkan kandungan Cu, Zn-SOD
yang tinggi setelah mendapatkan perlakuan yogurt sinbiotik terminasi hari ke-8. Lalu, setelah mendapatkan perlakuan intervensi EPEC, namun masih mendapat perlakuan yogurt sinbiotik
terminasi hari ke-15, kelompok tersebut memperlihatkan penurunan kandungan Cu, Zn-SOD. Selanjutnya, tikus kelompok yogurt sinbiotik + EPEC mengalami peningkatan kandungan Cu, Zn-
SOD kembali setelah intervensi EPEC dihentikan terminasi hari ke-22. Hal ini membuktikan bahwa perlakuan dengan yogurt sinbiotik dapat mempertahankan kandungan enzim Cu, Zn-SOD sehingga
dapat menjaga keseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas dan selanjutnya tetap menjaga integritas sel-sel tubuh. Penyebabnya adalah probiotik L. fermentum mampu menstimulasi sistem
imun. Peran et al. 2006 menyebutkan bahwa perlakuan dengan L. fermentum menunjukkan pemulihan dari respon inflamasi pada tikus kolitis mengalami radang usus besar.
4.2.5 Kandungan Enzim Superoksida Dismutase SOD pada Jaringan Ginjal
