WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Susut pengeringan ANALISA DATA

22

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 hingga Mei 2014. Pembuatan ekstrak dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, pemeliharaan dan perlakuan hewan uji di Animal House AH. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. ALAT DAN BAHAN

3.2.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender Philips, timbangan analitik AND GH-202 dan Wiggen Hauser, botol maserasi, vacuum rotary evaporator EYELA, erlenmeyer, beaker glass, batang pengaduk, spatula, kertas saring, kapas, corong gelas, tabung reaksi, pipet tetes, cawan penguap, botol timbang, kurs silikat, oven Memmert, tanur Thermo Scientific, freeze dryer, alumunium foil, timbangan, kandang tikus beserta tempat makanan dan minum, sonde oral, syringe, wadah pembiusan, alat bedah minor, kaca objek dan cover glass, mikropipet Eppendorf Research plus, Eppendorf tube, centrifuge, vortex, mikroskop cahaya Motic dan Epson, Hemositometer Improved Neubauer NESCO, freezer, waterbath, desikator, Kit ELISA dan ELISA reader.

3.2.2. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol 70 dari biji buah manggis Garcinia mangostana L. yang diperoleh dari Perkebunan Manggis di Lubuk Alung, Padang. Sebelum dilakukan penelitian, buah manggis terlebih dahulu dideterminasi di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi – LIPI Bogor untuk memastikan kebenaran bahan uji. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 70, pereaksi untuk penapisan fitokimia HCl pekat; HCl 2N; pereaksi Mayer; asam asetat anhidrat; asam sulfat pekat; magnesium; ammoniak 1; kloroform; Aquadest; H 2 SO 4 pekat; FeCl 3 0,1; pereaksi stiasny; natrium asetat. Natrium karbonil metil selulosa untuk penyiapan suspensi zat aktif. Penyiapan sperma normal saline water; larutan George; NaCl fisiologis; dan larutan Baker‟s buffer glukosa 3; Na 2 HPO 4 2 H 2 O 0,31; NaCl 0,2; KH 2 PO 4 0,01.

3.2.3. Hewan Uji

Hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan strain Sprague Dawley yang sehat dan fertil berumur 2,5 – 3 bulan dengan berat badan 200-300 gram yang diperoleh dari Animal Facility and Modeling Provider Institut Pertanian Bogor IPB.

3.3. RANCANGAN PENELITIAN

3.3.1. Besar Sampel

Penelitian ini bersifat eksperimental yang terbagi dalam 5 kelompok perlakuan yang masing – masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan strain Sprague Dawley WHO,2000. Hewan uji yang digunkan sebanyak 25 ekor tikus.

3.3.2. Dosis Perlakuan

Acuan dosis yang digunakan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Azrifitria 2012. Perhitungan dosis yang diberikan dapat dilihat pada lampiran. Pemberian ekstrak dilakukan selama 48 hari sesuai dengan siklus spermatogenesis tikus Krinke, 2000. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.1. Rancangan Percobaan Kelompok Perlakuan Lama Pemberian PengukuranBagian yang digunakan I Kontrol Tikus diberikan Natrium CMC 0,5 sebanyak 1 mL0,2kgBB. 48 hari  Darah dari vena lateral ekor testosteron Serum  Sperma dikeluarkan dari Kauda epididimis II Dosis rendah Tikus diberikan ekstrak biji manggis Garcinia mangostana L dengan dosis 1mg0,2 kgBB 48 hari  Darah dari vena lateral ekor testosteron Serum  Sperma dikeluarkan dari Kauda epididimis III Dosis sedang Tikus diberikan ekstrak biji manggis Garcinia mangostana L dengan dosis 10mg0,2 kgBB 48 hari  Darah dari vena lateral ekor testosteron Serum  Sperma dikeluarkan dari Kauda epididimis IV Dosis tinggi Tikus diberikan ekstrak biji manggis Garcinia mangostana L dengan dosis 20mg0,2 kgBB 48 hari  Darah dari vena lateral ekor testosteron Serum  Sperma dikeluarkan dari Kauda epididimis V aktivitas Spermisi- dal Tikus dimatikan, kemudian sperma dikeluarkan dari kauda epididimis untuk uji aktivitas spermisidal - Sperma dikeluarkan dari Kauda epididimis

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Penyiapan Simplisia dan Pembuatan Ekstrak

Sebanyak 100 kg buah manggis yang telah matang dikupas, bijinya dipisahkan dan dikumpulkan. Biji manggis yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan dikering-anginkan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Biji manggis yang telah kering dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk. Serbuk biji manggis ditimbang dan dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 selama 72 jam kemudian disaring. Proses maserasi ini diulang hingga dihasilkan maserat yang berwarna pucat mendekati tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Jika belum didapatkan ekstrak kental, maka proses pemekatan ekstrak dilanjutkan dengan freeze dryer dan kemudian ekstrak kental ditimbang.

3.4.2. Penapisan Fitokimia

Pengujian golongan metabolit sekunder dilakukan terhadap golongan : 1. Tanin Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam cawan ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk dibagi menjadi 3 tabung reaksi, tabung pertama ditambahkan FeCl 3 sebanyak 3 tetes, jika menghasilkan biru karakteristik, biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan. Kedua, ditambahkan pereaksi stiasny kemudian dipanaskan, positif tanin terkondensasi berwana merah jambu. Ketiga, ditambahkan natrium asetat dan FeCl 3 , positif tanin terhidrolisis biru tinta Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, Vahidipour, 2003. 2. Alkaloid Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk, ditambahkan 5 ml HCl 2 N, dipanaskan pada penangas air. Setelah dingin, campuran disaring dan filtrat ditambahkan beberapa tetes reagen Mayer. Sampel kemudian diamati hingga keruh atau ada endapan Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, Vahidipour, 2003. 3. Saponin Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk, ditambahkan dengan 20 mL aquabides dan dikocok kemudian didiamkan selama 15-20 menit.Jika tidak ada busa = negatif; busa lebih dari 1 cm = positif lemah; busa dengan tinggi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 1,2 cm = positif; dan busa lebih besar dari 2 cm = positif kuat Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, Vahidipour, 2003; Sarma Babu, 2011. 4. Flavonoid Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam cawan ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk, ditambahkan serbuk magnesium 0,5 g dan 3 tetes HCl pekat. Terbentuknya warna jingga sampai merah menunjukkan adanya flavon, merah sampai merah padam menunjukkan flavanol, merah padam sampai merah keunguan menunjukkan flavanon Mojab, Kamalinejad, Ghaderi, Vahidipour, 2003. 5. Terpenoid Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk, ditambahkan 1 mL kloroform dan 1 mL asetat anhidrida lalu didinginkan. Setelah dingin, ditambahkan H 2 SO 4 . Jika terjadi warna kemerahan, menunjukkan adanya triterpenoid Mandal dan Ghasal, 2012. 6. Steroid Sebanyak 0,5 gram ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL etanol 70 kemudian diaduk, ditambahkan 2 mL kloroform, kemudian ditambahkan 2 mL H 2 SO 4 pekat dengan cara diteteskan pelan-pelan dari sisi dinding tabung reaksi. Pembentukan cincin warna merah menunjukkan adanya steroid Mandal dan Ghasal, 2012.

3.4.3. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik 1.

Parameter Spesifik Identitas ekstrak dengan deskripsi tata nama sebagai berikut:  nama ekstrak,  nama latin tumbuhan sistematika botani,  bagian tumbuhan yang digunakan,  nama Indonesia tumbuhan Depkes RI, 2000. Organoleptik diamati menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut:  bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair,  warna : kuning, coklat dll, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta  bau : aromatic, tidak berbau dll,  rasa : manis, pahit, kelat dll Depkes RI, 2000.

2. Parameter Non Spesifik

a. Susut pengeringan

Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 o C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol hingga membentuk lapisan setebal 5 mm sampai 10 mm. jika ekstrak yang diuji adalah ekstrak kental, ratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar. Jika ekstrak sulit kering dan mencair pada pemanasan, ditambahkan 1 gram silica pengering yang telah ditimbang secara seksama. Setelah dikeringkankan dan disimpan dalam desikator pada suhu kamar, silica tersebut dicampurkan secara rata dengan ekstrak pada saat panas, kemudian keringkan kembali pada suhu penetapan hingga bobot tetap Depkes RI, 2000.

b. Kadar abu

Sebanyak 2 gram ekstrak yang telah digerus dan timbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas dan kertas saring dalam kurs yang sama. Masukkan filtrat ke dalam kurs, uapkan. Kemudian pijarkan hingga bobot tetap, lalu ditimbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 2000. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.4. Penyiapan Hewan Coba

Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasi di animal house Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama 1 minggu. Diberi makan dan minum ad libitum. Ekstrak etanol biji manggis diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari selama 48 hari dengan dosis seperti tertera pada tabel rancangan percobaan Tabel 3.1. 1. Kelompok I diberikan suspensi Natrium CMC. 2. Kelompok II ekstrak biji manggis 1 mg0,2 kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC. 3. Kelompok III ekstrak biji manggis 10 mg0,2kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC. 4. Kelompok IV ekstrak biji manggis 20 mg0,2kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC.

3.4.5. Pengukuran Parameter

1. Perhitungan konsentrasi spermatozoa Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan dalam cawan penguap yang berisi cairan NaCl sebanyak 500 µL. spermatozoa dimasukkan ke dalam kamar Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2. Ilyas, 2007 Tabel 3.2. pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung No. Jumlah Spermatozoa dalam 1 kotak Faktor pengenceran Kotak kecil yang dihitung 1. 40 50 kali 5 2. 15-40 20 kali 10 3. 15 10 kali 25 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung Ilyas, 2007. Tabel 3.3. Cara Pengenceran No . Pengencera n Pembuatan Pengenceran 1. 50 kali a. 980 µL larutan George + 20 µL spermatozoa b. 2.450 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa 2. 20 kali 950 µL larutan George + 50 µL spermatozoa 3. 10 kali a. 900 µL larutan George + 100 µL spermatozoa b. 450 µL larutan George + 50 µL spermatozoa Setelah pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada table 3.3. Kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi spermatozoa sesuai dengan rumus di bawah ini Ilyas, 2007 3.2 Keterangan: n = jumlah spermatozoa yang dihitung 10.000 = volume kamar hitung Neubauer Fp = factor pengenceran 25 = total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer k = kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan vNaCl = volume NaCl fisiologis mL yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa dari kauda epididimis. Perhitungan konsentrasi spermatozoa jutamL dapat terlihat dari tabel 3.4 berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.4. Rumus Konsentrasi Spermatozoa No. Jumlah kotak yang dihitung Rumus konsentrasi Spermatozoa 1. 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5 2. 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5 3. 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5 2. Konsentrasi hormon testosteron Selama 48 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan ekstrak etanol biji manggis per oral. Pada hari ke 0 dan 49 dilakukan pengambilan darah melalui vena lateral ekor sebanyak 1 mL, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Darah dalam tube disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm untuk memisahkan serum yang akan digunakan untuk mengukur konsentrasi testosteron tikus. Serum kemudian disimpan dalam freezer suhu -20 o C sampai hari ke-49. Pengukuran konsentrasi hormon testosteron plasma dilakukan di laboratorium dengan menggunakan kit ELISA Testosteron dari DRG International pada hari ke 48. Kadar hormon minimal yang dapat terdeteksi pada kit ini adalah 0,086 ngmL. Prosedur pengukuran hormon dilakukan berdasarkan instruksi manual yang disertakan dalam kit Tanga Krishna, 2012. Prosedur pengukuran kadar testosteron menggunakan kit ELISA, larutan standar, kontrol dan sampel, dipipet masing-masing sebanyak 25 µL ke dalam wells. Enzyme conjugate dipipet sebanyak 200 µL ke dalam setiap wells, kemudian dicampurkan selama 10 detik. Hal yang penting adalah tahap pencampuran hingga selesai. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan tanpa menutup plate, wells kemudian digoyangkan dengan cepat. Wells diteteskan dengan wash solution 400 µL per well , wells diletakan di atas kertas penyerap untuk menhapus sisa tetesan. Substrate solution sebanyak 200 µL ditambahkan ke dalam wells. Setelah itu diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan. Penghentian reaksi enzimatik dilakukan dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta penambahan stop solution sebanyak 100 µL ke dalam setiap wells. Tentukan nilai absorbansi setiap wells pada 450 ± 10 nm dengan microtiter plate reader waktu yang direkomendasikan untuk membaca nilai absorbansi setiap wells adalah 10 menit setelah penambahan stop solution. 3. Aktivitas Spermisidal Aktivitas spermisidal ditentukan dengan menggunakan versi modifikasi dari protokol asli Sander dan Metode Cramer yang mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100 sperma dalam 20 detik. Tikus yang digunakan adalah tikus yang fertil. Tikus kemudian dikorbankan untuk mengambil kauda epididimis kemudian semen dikumpulkan dan diinkubasi dengan normal saline water untuk uji in vitro dari sperma tikus. Sperma yang digunakan memp unyai motilitas ≥50 Ashish Ranjan Singth, 2013, sehingga dilakukan pengujian motilitas sperma yang akan digunakan untuk membuktikan bahwa tikus yang digunakan fertil. Ekstrak etanol 70 biji manggis dengan berbagai konsentrasi 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 mgmL dicampur dengan suspensi sperma yang mengandung 1 juta sperma. Campuran diamati di bawah mikroskop selama 20 detik di perbesaran 10X dan diamati motilitas sperma. Konsentrasi dicatat jika ada sperma motil yang terlihat, lalu 250 µL buffer ditambahkan ke semua campuran dan diinkubasi pada suhu 37°C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut perlahan-lahan di vortex dan diamati lagi setiap sperma yang motil. Konsentrasi dicatat sebagai hasil yang efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil. Titik akhir adalah konsentrasi terendah dari Ekstrak biji manggis yang menyebabkan imobilisasi semua sperma dalam 20 detik pencampuran Ashish Ranjan Singth, 2013. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.5. ANALISA DATA

Data hasil percobaan dianalisis untuk melihat penurunan konsentrasi spermatozoa, testosteron dan aktivitas spermisidal dari masing-masing kelompok perlakuan. Analisis data menggunakan program pengolahan data statistic SPSS 16 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas, uji parametrik one-way ANOVA atau non parametrik Kruskal Wallis. Jika hasil dari uji ANOVA maupun Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang nyata p≤0,05 maka analisis data dilanjutkan menggunakan uji Least Significant Difference LSD. 33

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENELITIAN

4.1.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman uji adalah benar tanaman manggis Garcinia mangostana L suku Clusiaceae. Surat pernyataan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

4.1.2 Ekstraksi

Dari 100 kg buah manggis segar, diperoleh 186,56 gram serbuk biji manggis Garcinia mangostana L.. Serbuk biji manggis dimaserasi dengan etanol 70 hingga dihasilkan maserat yang berwarna pucat lebih bening daripada maserat awal. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak yang diperoleh belum menjadi ekstrak kental, maka ekstrak dipekatkan dengan freeze dryer di Pusat Penelitian Mikrobiologi-LIPI Bogor. Ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 19,92 gram. Sehingga dihasilkan rendemen 10,68, perhitungan rendemen dapat dilihat pada lampiran 7.

4.1.3 Penapisan Fitokimia Ekstrak

Hasil penapisan fitokimia ekatrak biji manggis Garcinia mangostana L. ditunjukkan pada tabel 4.1 Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Penapisan Fitokimia Hasil Tanin Positif Alkaloid Negatif Flavonoid Positif Saponin Negatif Terpenoid Positif Steroid Positif