UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4. Penyiapan Hewan Coba
Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasi di animal house Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama 1 minggu. Diberi makan
dan minum ad libitum. Ekstrak etanol biji manggis diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari selama 48 hari dengan dosis seperti
tertera pada tabel rancangan percobaan Tabel 3.1. 1. Kelompok I diberikan suspensi Natrium CMC.
2. Kelompok II ekstrak biji manggis 1 mg0,2 kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC.
3. Kelompok III ekstrak biji manggis 10 mg0,2kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC.
4. Kelompok IV ekstrak biji manggis 20 mg0,2kgBB yang disuspensikan ke dalam larutan Natrium CMC.
3.4.5. Pengukuran Parameter
1. Perhitungan konsentrasi spermatozoa Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara
mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan dalam cawan penguap yang berisi cairan NaCl
sebanyak 500 µL. spermatozoa dimasukkan ke dalam kamar Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung
jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak
yang akan dihitung Tabel 3.2. Ilyas, 2007 Tabel 3.2. pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung
No. Jumlah Spermatozoa
dalam 1 kotak Faktor
pengenceran Kotak
kecil yang dihitung
1. 40
50 kali 5
2. 15-40
20 kali 10
3. 15
10 kali 25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung Ilyas,
2007. Tabel 3.3. Cara Pengenceran
No .
Pengencera n
Pembuatan Pengenceran 1.
50 kali a. 980 µL larutan George + 20 µL
spermatozoa b. 2.450 µL Larutan George + 50 µL
spermatozoa 2.
20 kali 950 µL larutan George + 50 µL spermatozoa
3. 10 kali
a. 900 µL larutan George + 100 µL spermatozoa
b. 450 µL larutan George + 50 µL spermatozoa
Setelah pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara
pengenceran pada table 3.3. Kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi spermatozoa sesuai dengan rumus di bawah ini Ilyas, 2007
3.2 Keterangan:
n = jumlah spermatozoa yang dihitung
10.000 = volume kamar hitung Neubauer
Fp = factor pengenceran
25 = total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung
Neubauer k
= kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan vNaCl
= volume NaCl fisiologis mL yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa dari kauda epididimis.
Perhitungan konsentrasi spermatozoa jutamL dapat terlihat dari tabel 3.4 berikut.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 3.4. Rumus Konsentrasi Spermatozoa No. Jumlah
kotak yang
dihitung Rumus konsentrasi Spermatozoa
1. 5
n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5 2.
10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5
3. 25
n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5 2. Konsentrasi hormon testosteron
Selama 48 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan ekstrak etanol biji manggis per oral. Pada hari ke 0 dan 49
dilakukan pengambilan darah melalui vena lateral ekor sebanyak 1 mL, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Darah dalam tube disentrifugasi
dengan kecepatan 3.000 rpm untuk memisahkan serum yang akan digunakan untuk mengukur konsentrasi testosteron tikus. Serum
kemudian disimpan dalam freezer suhu -20
o
C sampai hari ke-49. Pengukuran konsentrasi hormon testosteron plasma dilakukan di
laboratorium dengan menggunakan kit ELISA Testosteron dari DRG International pada hari ke 48. Kadar hormon minimal yang dapat
terdeteksi pada kit ini adalah 0,086 ngmL. Prosedur pengukuran hormon dilakukan berdasarkan instruksi manual yang disertakan dalam kit
Tanga Krishna, 2012. Prosedur pengukuran kadar testosteron menggunakan kit ELISA,
larutan standar, kontrol dan sampel, dipipet masing-masing sebanyak 25 µL ke dalam wells. Enzyme conjugate dipipet sebanyak 200 µL ke dalam
setiap wells, kemudian dicampurkan selama 10 detik. Hal yang penting adalah tahap pencampuran hingga selesai. Campuran tersebut kemudian
diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan tanpa menutup plate, wells kemudian digoyangkan dengan cepat. Wells diteteskan dengan
wash solution 400 µL per well , wells diletakan di atas kertas penyerap untuk menhapus sisa tetesan. Substrate solution sebanyak 200 µL
ditambahkan ke dalam wells. Setelah itu diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan. Penghentian reaksi enzimatik dilakukan dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
penambahan stop solution sebanyak 100 µL ke dalam setiap wells. Tentukan nilai absorbansi setiap wells pada 450 ± 10 nm dengan
microtiter plate reader waktu yang direkomendasikan untuk membaca nilai absorbansi setiap wells adalah 10 menit setelah penambahan stop
solution. 3. Aktivitas Spermisidal
Aktivitas spermisidal ditentukan dengan menggunakan versi modifikasi dari protokol asli Sander dan Metode Cramer yang
mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100 sperma dalam 20 detik. Tikus yang digunakan adalah
tikus yang fertil. Tikus kemudian dikorbankan untuk mengambil kauda epididimis kemudian semen dikumpulkan dan diinkubasi dengan normal
saline water untuk uji in vitro dari sperma tikus. Sperma yang digunakan memp
unyai motilitas ≥50 Ashish Ranjan Singth, 2013, sehingga dilakukan pengujian motilitas sperma yang akan digunakan untuk
membuktikan bahwa tikus yang digunakan fertil. Ekstrak etanol 70 biji manggis dengan berbagai konsentrasi
50, 60, 70, 80, 90 dan 100 mgmL dicampur dengan suspensi sperma yang mengandung 1 juta sperma. Campuran diamati di bawah mikroskop
selama 20 detik di perbesaran 10X dan diamati motilitas sperma. Konsentrasi dicatat jika ada sperma motil yang terlihat, lalu 250 µL
buffer ditambahkan ke semua campuran dan diinkubasi pada suhu 37°C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut perlahan-lahan di vortex dan
diamati lagi setiap sperma yang motil. Konsentrasi dicatat sebagai hasil yang efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil.
Titik akhir adalah konsentrasi terendah dari Ekstrak biji manggis yang menyebabkan imobilisasi semua sperma dalam 20 detik pencampuran
Ashish Ranjan Singth, 2013.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.5. ANALISA DATA
Kategori