Tempat dan Waktu Penelitian. Alat dan Bahan Analisa Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian.

Penelitian ini dilakukan pada bulan April sampai dengan bulan Juli tahun 2010 dan bertempat di Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jum’at Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, mikropipet, refrigerator, sentrifuse, pH meter, spektrofotometer Uv-vis, autoklaf, pipet tetes, Gas Chromatograph Mass Spectrometer GC-MS Shimadzu dan Mini Protein-Gel Elektroforesis “Atto”. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah batubara subbituminus, kertas whatman No.1, alkohol 70 , NaCl 0,85 , isolat kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. koleksi dari BATAN Irawan Sugoro, aseton, akuades, medium Potato Dextrose Agar PDA, Medium Minimal Salt MMS, agar bakto, sukrosa 1 , Lowry I 2 Na 2 CO 3 dalam NaOH 0,1 N ; 2,7 K.Na tartat; 2 CuSO 4 , Lowry II Folin dan akuades 1:1 , Larutan Standar BSA, buffer sampel, Separating Gel 10 dan Stacking Gel 45, tanin, methylene blue, manganese chloride, dan fluorescien diacetate.

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Persiapan Serbuk Batubara

Batubara dihaluskan menggunakan mortar secara aseptik, kemudian disaring menggunakan saringan berukuran 0,2 mm 70 mesh. Serbuk batubara yang telah siap ditimbang sebanyak 5 gr dan dimasukkan ke dalam plastik polyetilen. Serbuk batubara ditutup rapat dan diiradiasi gamma 5 kGy dan tidak diiradiasi 0 kGy.

3.3.2. Pembuatan Medium

Tabel 2. Komposisi medium perlakuan No. Nama Medium PDA ml Agar bakto gr MMS ml Sukrosa Serbuk Batubara Keterangan 1. Potato Dextrose Agar Minimal Salt PDAM 75 0,75 75 - - Untuk peremajaan kapang 2. Medium Minimal Salt + Sukrosa MMSS - - 600 1 2 Untuk proses biosolubilisasi.

3.3.2.1. Medium Potato Dextrose Agar

Sebanyak 39 gr PDA dilarutkan dalam 1 liter akuades, kemudian ditambahkan agar bakto sebanyak 10 gr. Medium PDA dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirer agar terlarut. Medium PDA tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15 menit.

3.3.2.2. Medium Minimal Salt MMS

Sebanyak 0,52 gr MgSO 4. 7H 2 O; 0,003 gr ZnSO4.7H2O pH 5,5 ; 5 gr K 2 HPO 4 ; 0,005 gr FeSO 4 , dan 1 gr NH 4 SO 4 dilarutkan dalam 1 liter akuades, kemudian dilarutkan sampai homogen. Medium MMS tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15 menit Silva et al., 2007.

3.2.2.3. Medium Potato Dextrose Agar Minimal Salt PDAM

Medium PDAM dibuat dengan mencampurkan medium PDA dan MMS dengan perbandingan 1:1 atau 75 ml : 75 ml. Medium PDA ditambahkan 1 agar bakto atau 0,75 gr. Medium PDA dan MMS disterilisasi dulu menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C dengan waktu 15 menit sebelum dicampurkan. Medium PDAM dihomogenkan dengan cara pengadukan. Sebanyak 5 ml dimasukkan tabung reaksi untuk peremajaan kapang pada tabung reaksi agar miring. 3.2.2.4. Medium Minimal Salt + Sukrosa MMSS Sebanyak 600 ml MMS ditambahkan sukrosa sebanyak 1 6 gr sukrosa lalu dihomogenkan, kemudian 100 ml MMSS dimasukkan ke dalam erlenmeyer. MMSS disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C dengan waktu 15 menit.

3.3.3. Peremajaan Kultur Kapang

Sebanyak 5 ml medium PDAM di masukkan ke dalam tabung reaksi untuk agar miring. Kultur stokisolat kapang diinokulasikan pada medium PDAM tersebut menggunakan ose. Kultur kapang tersebut diinkubasi pada suhu ruang sampai kapang menghasilkan spora, selama 5-7 hari pada suhu ruang.

3.3.4. Kultur Inokulum Spora

Kultur spora yang sudah diremajakan pada medium PDAM, kemudian diambil sporanya menggunakan ose. Kultur spora pada medium ditambahkan 5 ml NaCl steril 0,85 sambil dilepaskan sporanya menggunakan ose, kemudian dimasukkan ke dalam yellow tube steril.

3.3.5. Uji Enzim Ekstraseluler

3.3.5.1. Fenoloksidase

Pengujian berdasarkan reaksi kimia warna Bavendamm. Kapang ditumbuhkan pada medium PDA yang mengandung tanin 4 mML. Lingkaran warna coklat yang terbentuk menunjukkan adanya ekskresi fenoloksidase kapang Tao et al., 2009.

3.3.5.2. Peroksidase

Metode penambahan warna medium untuk pengujian enzim peroksidase. methylene blue sebanyak 0,1 grL ditambahkan kedalam medium PDA dan kapang ditumbuhkan diatasnya. Pudarnya warna medium memperlihatkan kehadiran enzim peroksidase Tao et al., 2009.

3.3.5.3. Mangan Peroksidase

Sebanyak 1 grL Manganese cloride ditambahkan dalam medium PDA dan kapang diinokulasikan lalu diinkubasi selama 2 minggu. Selama masa inkubasi dilakukan pengamatan terhadap titik-titik hitam-coklat yang terbentuk. MnP mengkatalis terjadinya oksidasi MnCl 2 menjadi MnO 2 yang dihasilkan warna hitam-coklat Tao et al., 2009.

3.3.6. Pengukuran pH medium

Medium diukur nilai pHnya dengan menggunakan pH meter. Selanjutnya dibuat grafik perubahannya.

3.3.7. Pengujian Biosolubilisasi Batubara

Kultur inokulum spora sebanyak 10 vv diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi 100 ml MMSS. Kemudian, ditambahkan sebanyak 2 serbuk batubara 2 gr dengan masing-masing yang tidak diiradiasi 0 kGy dan diiradiasi 5 kGy. Kultur kapang diinkubasi pada suhu ruang. Kultur ini dinamakan kultur diam tanpa adanya mengocokan selama pertumbuhan kapang Gadjar et al., 2006. Pencuplikan sampel kultur kapang dilakukan pada hari ke 0, 7, 14, 21, 28 dan 35 untuk pengukuran biosolubilisasi terhadap batubara Scott and Lewis, 1990. Tabel 3. Data perlakuan kultur kapang Kapang Dosis Iradiasi Serbuk Batubara Medium MMS+ 1 Sukrosa Inokulum spora kapang tanpa batubara 100 ml 10 vv tidak diiradiasi 0 kGy 100 ml 10 vv Penicillium sp. diiradiasi 5 kGy 100 ml 10 vv tanpa batubara 100 ml 10 vv tidak diiradiasi 0 kGy 100 ml 10 vv Trichoderma sp. diiradiasi 5 kGy 100 ml 10 vv 3.3.7.1. Pengukuran Biosolubilisasi Batubara Sampel pada kultur diam diambil sebanyak 10 ml menggunakan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam yellow tube steril. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 5400 rpm selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi diambil menggunakan pipet tetes kemudian dimasukkan dalam yellow tube steril, kemudian diukur nilai absorbansinya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat solubilisasi batubara Selvi, 2007. Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula.

3.3.8. Pengukuran Hidrolisis FDA

Supernatan dimasukkan 1 ml ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 ml KH 2 PO 4 buffer pH 7,6 60 mM. Reaksi dimulai dengan menambahkan 40 µg FDA Fluorescien diacetate dalam 4 ml aseton, kemudian diinkubasi dalam pengocokan selama 20 menit. Setelah penginkubasian segera ditambahkan aseton sebanyak 4 ml untuk menghentikan reaksi. Suspensi disaring dengan kertas Whatman No. 1, filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditutup dengan kertas parafilm dan disimpan dalam es batu untuk menguapkan aseton. Nilai OD ditera dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm Breeuwer, 1996.

3.3.9. Pengukuran Kadar Protein Eketraseluler dengan Metode Lowry

Sebanyak 0,5 ml sampel ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry I dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 ml larutan Lowry II, divortek dan diinkubasi pada suhu ruang selam 30 menit. Setelah itu absorbansi dibaca dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan standar Bovine Serum Albumin BSA Apriyanto et al., 1989. Pengukuran kadar protein ekstraseluler bertujuan untuk mengetahui seberapa besar enzim ekstraseluler diekresikan oleh kapang.

3.3.10. Analisis Hasil Biosolubilisasi Batubara oleh Kapang Penicilium sp.

dan Trichoderma sp. Dengan Menggunakan GC-MS Supernatan dan pelarut dicampurkan dengan perbandingan 1:1. Pelarut yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter dengan perbandingan 3:1:1. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam corong Buchner lalu diaduk sampai bercampur kemudian didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan bawah. Fase atas dipakai untuk identifikasi jenis senyawa produk hasil biosolubilisasi batubara dan menentukan kadarnya dengan menggunakan GC-MS Shimadzu. Kolom yang digunakan adalah Dimethyl polysiloxana dengan kondisi suhu kolom oven 50 C, suhu injeksi 280 C, laju alir 1,54 mlmenit, dan fase gerak gas helium. Kontrol yang digunakan adalah medium MMSS yang ditambahkan serbuk batubara yang diiradiasi dan tidak diiradiasi Silva et al., 2007.

3.3.11. Karakteristik Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis

Karakterisasi enzim ekstraseluler dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan SDS-PAGE. Adapun tahapan kerja yang dilakukan antara lain: 1. Preparasi sampel Sebanyak 30 µl supernatan ditambahkan 50 µl buffer sampel lalu dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifus dengan 6000 rpm selama 10 menit. 2. Preparasi gel elektroforesis a. Separating gel 10 Sebanyak 6 ml Acrylamid 30 dicampurkan dengan separating gel buffer 1,5 Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 4,5 ml kemudian akuabides 7,5 ml, SDS 50 µl, amonium persulfate APS 0,08 ml dan TEMED 0,01 ml. b. Stacking gel 45 Sebanyak 0,9 ml Acrylamid 30 dicampurkan dengan separating gel buffer 1,5 Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 1,5 ml kemudian akuabides 3,6 ml, SDS 25 µl, amonium persulfate APS 0,02 ml dan TEMED 0,01 ml. 3. Proses Elektroforesis Setelah separating gel dibuat, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan akuades untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku, akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu dipasang sisir pembentuk kolom dan dibiarkan hingga stacking gel membeku kemudian sisir diangkat. Sebanyak 600 ml larutan running buffer dimasukkan dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kolom gel yang sudah terbentuk lalu dielekroforesis dengan kecepatan 200 Volt dan kuat arus 40 mA selama lebih kurang 1 sampai 2 jam atau hingga warna biru sebagai penanda pada sampel mencapai batas bawah gel. Gel diangkat lalu diwarnai dengan staining solution coomassie blue R- 250 kurang lebih selama 24 jam.Gel dicuci dengan larutan destaining yang terdiri atas methanol 40 , asam asetat 7,5 dan akuades kurang lebih selama 24 jam. Protein yang telah didestaining kemudian discan dan dianalisa dengan Lab.Image untuk menentukan nilai RF Retensi Faktor sebagai representasi dari profil protein yang dihasilkan dan berat molekulnya.

3.4. Analisa Data

Data penelitian ini dianalisis dengan menggunakan Rancangan Acak lengkap RAL yang dianalisis dengan Analisis Varian ANOVA satu arah untuk mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh yang signifikan pada tiap perlakuan. Uji Anaisis Varian ini ANOVA dibantu dengan bantuan program SPSS 16.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Analisis Kualitatif Enzim Ekstraseluler Kapang

Pengujian enzim ekstraseluler kapang sangatlah penting dilakukan sebelum proses biosolubilisasi batubara. Pengujian ini bertujuan mengetahui ada atau tidaknya enzim ekstraseluler kapang yang berperan dalam proses biosolubilisasi batubara. Uji enzim ini menggunakan substrat atau pereaksi tanin, methylene blue dan manganese chloride yang berbeda untuk setiap enzim. A.1 A.2 A.3 Fenoloksidase + Peroksidase + Mangan Peroksidase + B.1 B.2 B.3 Fenoloksidase + Peroksidase + Mangan Peroksidase + Gambar 4. Uji kualitatif adanya enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. A dan Trichoderma sp. B 34