3.3.10. Analisis Hasil Biosolubilisasi Batubara oleh Kapang Penicilium sp.
dan Trichoderma sp. Dengan Menggunakan GC-MS
Supernatan dan pelarut dicampurkan dengan perbandingan 1:1. Pelarut yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter dengan perbandingan 3:1:1.
Campuran tersebut dimasukkan ke dalam corong Buchner lalu diaduk sampai bercampur kemudian didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan
bawah. Fase atas dipakai untuk identifikasi jenis senyawa produk hasil biosolubilisasi batubara dan menentukan kadarnya dengan menggunakan GC-MS
Shimadzu. Kolom yang digunakan adalah Dimethyl polysiloxana dengan kondisi suhu kolom oven 50
C, suhu injeksi 280 C, laju alir 1,54 mlmenit, dan fase
gerak gas helium. Kontrol yang digunakan adalah medium MMSS yang ditambahkan serbuk batubara yang diiradiasi dan tidak diiradiasi Silva et al.,
2007.
3.3.11. Karakteristik Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis
Karakterisasi enzim ekstraseluler dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan SDS-PAGE. Adapun tahapan kerja yang dilakukan antara lain:
1. Preparasi sampel Sebanyak 30 µl supernatan ditambahkan 50 µl buffer sampel lalu
dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifus dengan 6000 rpm selama 10 menit.
2. Preparasi gel elektroforesis a.
Separating gel 10 Sebanyak 6 ml Acrylamid 30 dicampurkan dengan separating
gel buffer 1,5 Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 4,5 ml kemudian akuabides 7,5 ml, SDS 50 µl, amonium persulfate APS 0,08 ml dan TEMED
0,01 ml. b.
Stacking gel 45 Sebanyak 0,9 ml Acrylamid 30 dicampurkan dengan separating
gel buffer 1,5 Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 1,5 ml kemudian akuabides 3,6 ml, SDS 25 µl, amonium persulfate APS 0,02 ml dan TEMED
0,01 ml. 3. Proses Elektroforesis
Setelah separating gel dibuat, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan
akuades untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku, akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit,
lalu dipasang sisir pembentuk kolom dan dibiarkan hingga stacking gel membeku kemudian sisir diangkat.
Sebanyak 600 ml larutan running buffer dimasukkan dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kolom
gel yang sudah terbentuk lalu dielekroforesis dengan kecepatan 200 Volt dan kuat arus 40 mA selama lebih kurang 1 sampai 2 jam atau hingga warna biru
sebagai penanda pada sampel mencapai batas bawah gel.
Gel diangkat lalu diwarnai dengan staining solution coomassie blue R- 250 kurang lebih selama 24 jam.Gel dicuci dengan larutan destaining yang
terdiri atas methanol 40 , asam asetat 7,5 dan akuades kurang lebih selama 24 jam. Protein yang telah didestaining kemudian discan dan dianalisa
dengan Lab.Image untuk menentukan nilai RF Retensi Faktor sebagai representasi dari profil protein yang dihasilkan dan berat molekulnya.
3.4. Analisa Data
Data penelitian ini dianalisis dengan menggunakan Rancangan Acak lengkap RAL yang dianalisis dengan Analisis Varian ANOVA satu arah untuk
mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh yang signifikan pada tiap perlakuan. Uji Anaisis Varian ini ANOVA dibantu dengan bantuan program
SPSS 16.
Kategori