2.5. Kromatografi Gas Spektroskopi Massa GC-MS
Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa atau sering disebut GCMS Gas Chromatography Mass Spectrometry
adalah teknik analisis yang menggabungkan dua metode analisis yaitu Kromatografi Gas dan Spektroskopi
Massa. Kromatografi gas adalah metode analisis, dimana sampel terpisahkan secara fisik menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil hasil pemisahan
dapat dilihat berupa kromatogram. Sedangkan spektroskopi massa adalah metode analisis, dimana sampel yang dianalisis akan diubah menjadi ion-ion gasnya, dan
massa dari ion-ion tersebut dapat diukur berdasarkan hasil deteksi berupa spektrum massa Hermanto, 2008.
Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang diinginkan, sedangkan bila dilengkapi dengan MS berfungsi sebagai detektor
akan dapat mengidentifikasi komponen tersebut, karena bisa membaca spektrum bobot molekul pada suatu komponen, juga terdapat reference pada software
Hermanto, 2008. Pemisahan komponen senyawa dalam GCMS terjadi di dalam kolom
kapiler GC dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat yang ada di dalam kolom, sedangkan fase gerak adalah gas
pembawa Helium maupun Hidrogen dengan kemurnian tinggi, yaitu ± 99,995. Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap
molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan afinitas antar molekul dengan fase diam yang ada di dalam kolom. Selanjutnya
komponen-komponen yang telah dipisahkan tersebut masuk ke dalam ruang MS
yang berfungsi sebagai detektor secara instrumentasi, MS adalah detektor bagi GC Hermanto, 2008.
2.6. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada muatan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran Lehninger, 1982. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti protein dan
asam nukleat. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan.
Menurut Yuwono 2005, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik
yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah rasio muatan
terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Kegunaan elektroforesis adalah menentukan berat molekul estimasi.
Penetapan BM secara lebih teliti dapat dilakukan dengan ultrasentrifuge, meskipun dengan elektroforesis cukup memenuhi syarat, dapat mendeteksi
terjadinya pemalsuan bahan, dapat mendeteksi terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan dan penyimpanan, untuk memisahkan spesies molekul
yang berbeda secara kualitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat dianalisis dan menetapakan titik isoelektrik protein Lehninger, 1982.
Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE. Sodium Sodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SDS-PAGE terutama dilakukan untuk mengetahui apakah suatu protein monometrik ataukah
oligometrik, selain itu untuk menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer.
Pada mekanisme SDS-PAGE, protein bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionic membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein akan
terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS, berbentuk elips atau batang, dan berukuran sebanding dengan berat molekul protein. Protein
dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini dipisahkan berdasarkan muatan negatif ini dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara
elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat
molekulnya Ummubalqis, 2000. SDS-PAGE dilakukan pada pH normal. Pada metoda ini digunakan
anionic deterjent yang bersama dengan beta-merkaptoetanol dan pemanasan
menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil
. Hal ini menyebabkan oleh terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfihidril. SDS akan membentuk kompleks
dengan protein dan komleks ini bermuatan negatif karena gugus-gugus anion dari SDS. Pada pH 7, SDS 1 dan merkaptoetanol 0,1 M sebagian besar rantai protein
mengikat sekitar 1,4 gr SDS per gram protein, dengan demikian jumlah SDS yang terikat oleh protein adalah tetap. Oleh karena itu protein dapat dipisahkan
hanya berdasarkan ukurannya BM di dalam kompleks SDS protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang
lebih kecil Hames, 1998.
2.7. Iradiasi Gamma
Kategori