Persiapan Serbuk Batubara Peremajaan Kultur Kapang Kultur Inokulum Spora Pengukuran pH medium Pengujian Biosolubilisasi Batubara

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Persiapan Serbuk Batubara

Batubara dihaluskan menggunakan mortar secara aseptik, kemudian disaring menggunakan saringan berukuran 0,2 mm 70 mesh. Serbuk batubara yang telah siap ditimbang sebanyak 5 gr dan dimasukkan ke dalam plastik polyetilen. Serbuk batubara ditutup rapat dan diiradiasi gamma 5 kGy dan tidak diiradiasi 0 kGy.

3.3.2. Pembuatan Medium

Tabel 2. Komposisi medium perlakuan No. Nama Medium PDA ml Agar bakto gr MMS ml Sukrosa Serbuk Batubara Keterangan 1. Potato Dextrose Agar Minimal Salt PDAM 75 0,75 75 - - Untuk peremajaan kapang 2. Medium Minimal Salt + Sukrosa MMSS - - 600 1 2 Untuk proses biosolubilisasi.

3.3.2.1. Medium Potato Dextrose Agar

Sebanyak 39 gr PDA dilarutkan dalam 1 liter akuades, kemudian ditambahkan agar bakto sebanyak 10 gr. Medium PDA dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirer agar terlarut. Medium PDA tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15 menit.

3.3.2.2. Medium Minimal Salt MMS

Sebanyak 0,52 gr MgSO 4. 7H 2 O; 0,003 gr ZnSO4.7H2O pH 5,5 ; 5 gr K 2 HPO 4 ; 0,005 gr FeSO 4 , dan 1 gr NH 4 SO 4 dilarutkan dalam 1 liter akuades, kemudian dilarutkan sampai homogen. Medium MMS tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15 menit Silva et al., 2007.

3.2.2.3. Medium Potato Dextrose Agar Minimal Salt PDAM

Medium PDAM dibuat dengan mencampurkan medium PDA dan MMS dengan perbandingan 1:1 atau 75 ml : 75 ml. Medium PDA ditambahkan 1 agar bakto atau 0,75 gr. Medium PDA dan MMS disterilisasi dulu menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C dengan waktu 15 menit sebelum dicampurkan. Medium PDAM dihomogenkan dengan cara pengadukan. Sebanyak 5 ml dimasukkan tabung reaksi untuk peremajaan kapang pada tabung reaksi agar miring. 3.2.2.4. Medium Minimal Salt + Sukrosa MMSS Sebanyak 600 ml MMS ditambahkan sukrosa sebanyak 1 6 gr sukrosa lalu dihomogenkan, kemudian 100 ml MMSS dimasukkan ke dalam erlenmeyer. MMSS disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C dengan waktu 15 menit.

3.3.3. Peremajaan Kultur Kapang

Sebanyak 5 ml medium PDAM di masukkan ke dalam tabung reaksi untuk agar miring. Kultur stokisolat kapang diinokulasikan pada medium PDAM tersebut menggunakan ose. Kultur kapang tersebut diinkubasi pada suhu ruang sampai kapang menghasilkan spora, selama 5-7 hari pada suhu ruang.

3.3.4. Kultur Inokulum Spora

Kultur spora yang sudah diremajakan pada medium PDAM, kemudian diambil sporanya menggunakan ose. Kultur spora pada medium ditambahkan 5 ml NaCl steril 0,85 sambil dilepaskan sporanya menggunakan ose, kemudian dimasukkan ke dalam yellow tube steril.

3.3.5. Uji Enzim Ekstraseluler

3.3.5.1. Fenoloksidase

Pengujian berdasarkan reaksi kimia warna Bavendamm. Kapang ditumbuhkan pada medium PDA yang mengandung tanin 4 mML. Lingkaran warna coklat yang terbentuk menunjukkan adanya ekskresi fenoloksidase kapang Tao et al., 2009.

3.3.5.2. Peroksidase

Metode penambahan warna medium untuk pengujian enzim peroksidase. methylene blue sebanyak 0,1 grL ditambahkan kedalam medium PDA dan kapang ditumbuhkan diatasnya. Pudarnya warna medium memperlihatkan kehadiran enzim peroksidase Tao et al., 2009.

3.3.5.3. Mangan Peroksidase

Sebanyak 1 grL Manganese cloride ditambahkan dalam medium PDA dan kapang diinokulasikan lalu diinkubasi selama 2 minggu. Selama masa inkubasi dilakukan pengamatan terhadap titik-titik hitam-coklat yang terbentuk. MnP mengkatalis terjadinya oksidasi MnCl 2 menjadi MnO 2 yang dihasilkan warna hitam-coklat Tao et al., 2009.

3.3.6. Pengukuran pH medium

Medium diukur nilai pHnya dengan menggunakan pH meter. Selanjutnya dibuat grafik perubahannya.

3.3.7. Pengujian Biosolubilisasi Batubara

Kultur inokulum spora sebanyak 10 vv diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi 100 ml MMSS. Kemudian, ditambahkan sebanyak 2 serbuk batubara 2 gr dengan masing-masing yang tidak diiradiasi 0 kGy dan diiradiasi 5 kGy. Kultur kapang diinkubasi pada suhu ruang. Kultur ini dinamakan kultur diam tanpa adanya mengocokan selama pertumbuhan kapang Gadjar et al., 2006. Pencuplikan sampel kultur kapang dilakukan pada hari ke 0, 7, 14, 21, 28 dan 35 untuk pengukuran biosolubilisasi terhadap batubara Scott and Lewis, 1990. Tabel 3. Data perlakuan kultur kapang Kapang Dosis Iradiasi Serbuk Batubara Medium MMS+ 1 Sukrosa Inokulum spora kapang tanpa batubara 100 ml 10 vv tidak diiradiasi 0 kGy 100 ml 10 vv Penicillium sp. diiradiasi 5 kGy 100 ml 10 vv tanpa batubara 100 ml 10 vv tidak diiradiasi 0 kGy 100 ml 10 vv Trichoderma sp. diiradiasi 5 kGy 100 ml 10 vv 3.3.7.1. Pengukuran Biosolubilisasi Batubara Sampel pada kultur diam diambil sebanyak 10 ml menggunakan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam yellow tube steril. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 5400 rpm selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi diambil menggunakan pipet tetes kemudian dimasukkan dalam yellow tube steril, kemudian diukur nilai absorbansinya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat solubilisasi batubara Selvi, 2007. Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula.

3.3.8. Pengukuran Hidrolisis FDA