Uji aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas stabil DPPH. Sebanyak 1 mg ekstrak
kasar dan Vitamin C sebagai kontrol positif ditimbang dan kemudian ditambahkan dengan etanol dengan perbandingan 1:1000. Selanjutnya 1,3 mg DPPH
diencerkan dengan 25 mL etanol. Sebanyak 1 µL etanol diisikan ke dalam microplate yang telah disiapkan. Setelah itu dilakukan pengisian ekstrak dengan
beberapa konsentrasi dan penambahan larutan DPPH. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37
o
Persentase penghambat aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai absorben sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi
sampel dan persentase penghambat aktivitas radikal bebas. Nilai konsentrasi penghambat aktivitas radikal bebas sebanyak 50 IC
C selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 517 nm.
50
dihitung dengan menggunakan persamaan regresi. Nilai IC
50
diperoleh dengan memasukkan Y=50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC
50
dapat dihitung dengan persamaan. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan
antioksidan pembanding vitamin C dinyatakan dengan persen inhibisi yang dihitung dengan rumus berikut:
Y= A+B Lnx Keterangan: Y= persen inhibisi
A = slope B = intercept
x = konsentrasi sampel
3.3.5 Uji aktivitas antimikroba
Uji aktivitas antimikroba dilakukan terhadap ekstrak S. polycystum. Uji ini meliputi persiapan media padat TSA, persiapan media cair NB, persiapan suspensi
mikroba, persiapan media padat MHA, prosedur uji aktivitas antimikroba dengan berbagai konsentrasi dan pengukuran zona hambat. Mikroba uji yang digunakan
adalah E. coli dan S. aureus, B. subtilis dan C. maltosa. Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar.
a Persiapan media padat TSA
Penyegaran mikroba uji, yaitu E. coli dan S. aureus, B. subtilis dan C. maltosa dilakukan pada media Trypticase Soy Agar TSA. Media TSA
dibuat dengan melarutkan sebanyak 8 gram media TSA bubuk dalam akuades hingga volume 200 mL, lalu dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih.
Sebanyak 9 mL TSA dipipet dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Media lalu disterilisasi dengan
autoklaf pada suhu 121
o
b Persiapan media cair NB
C selama 15 menit. Setelah itu media dimiringkan sekitar 45 derajat dan dibiarkan hingga membeku. Setelah membeku media
selanjutnya disimpan dalam refrigerator .
Media Nutrient Broth NB dibuat dari 2,6 gram media NB bubuk yang dilarutkan dalam akuades hingga volume 200 mL, selanjutnya dipanaskan
sambil diaduk hingga mendidih. Sebanyak 9 mL NB dipipet ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan aluminium
foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
c Persiapan suspensi mikroba
C selama 15 menit. Setelah itu media didinginkan ditempat yang steril pada suhu
ruang.
Sebanyak 1 ose mikroba uji digoreskan pada media TSA dengan pola zig-zag secara aseptik, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Setelah itu 1-2 ose bakteri uji dari media TSA dimasukkan
ke dalam media NB yang telah dingin secara aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Optical Density OD
600 nm
d Persiapan media padat MHA
dihitung menggunakan spektrofotometer untuk menentukan fase hidup bakteri yang
digunakan. Nilai OD bakteri setelah inkubasi selama 12-18 jam tiap mikroba berbeda yaitu E. coli 0,607 nm, S. aureus 0,808 nm, B. subtilis 0,540 nm, dan
C. maltosa 0,663 nm.
Media padat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba adalah media Mueller Hinton Agar MHA. MHA dibuat dengan melarutkan
7,6 gram media MHA bubuk dalam akuades hingga volume 200 mL,
kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. Larutan dipipet 15 mL, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung
ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
e Uji aktivitas antimikroba modifikasi Darusman et a.l 1995 C selama 15 menit. Media
didinginkan pada suhu ruang sampai agar membeku. Setelah membeku, media disimpan dalam refrigerator.
Media MHA cair sebanyak 15 mL ditambah dengan 20 µL mikroba uji yang telah diukur OD-nya Optical Density antara 0,5-0,8 pada panjang
gelombang 600 nm. Media yang telah ditambah dengan mikroba uji dihomogenkan dengan vorteks, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri
steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar menyebar secara merata. Media agar tersebut didiamkan pada suhu ruang selama 15 menit atau
sampai agar membeku. Dalam uji aktivitas antimikroba, setiap sumur diberi ekstrak S. polycystum
sebanyak 20 µL dengan konsentrasi 2 mgmL, 1 mgmL dan 0,5 mgmL. Sumur juga diisi dengan kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan
konsentrasi 2 mgmL dan pelarut ekstrak sebagai kontrol negatif. Setelah seluruh ekstrak pada sumur dimasukkan dalam cawan petri yang telah berisi
agar dan mikroba kemudian cawan petri dilapisi dengan plastik wrapping untuk menghindari kontaminasi dan disimpan dalam inkubator dengan posisi
terbalik pada suhu 37
o
f Pengukuran zona hambat C selama 18-20 jam. Aktivitas antimikroba dapat dilihat
dengan mengamati zona hambat yang terbentuk di sekitar sumur. Diagram alir uji aktivitas antimikroba disajikan pada Gambar 4.
Aktivitas antimikroba dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling sumur dan aktivitas antimikroba dinyatakan
negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Zona hambat = A – B Keterangan :
A = Diameter zona hambat yang terbentuk mm B = Diameter sumur mm
Gambar 4 Tahapan uji aktivitas antimikroba ekstrak S. polycystum
modifikasi Darusman et al.1995
Pengamatan dan pengukuran zona bening Zona bening
Inkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Pemberian 20 µL ekstrak pada sumur dengan konsentrasi 2 mgmL, 1 mgmL dan
0,5 mgmL serta kontrol positif dan kontrol negatif Pembuatan sumur dalam media agar
Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku Penuangan agar ke dalam cawan petri steril
homogenisasi dengan vorteks Inokulasi mikroba 20 µL dalam 20 mL media MHA
Mikroba uji
3.4 Rancangan Percobaan dan Analisis Data
