III. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan selama 2 bulan dari bulan Februari sampai dengan bulan April 2010. Kegiatan pemeliharaan benih ikan dilakukan di
Laboratorium Lingkungan Akuakultur, analisis darah dan histologi insang dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pengujian kadar glukosa darah dilakukan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitan ini adalah sebagai berikut: kantong plastik, es batu, minyak sereh , dan benih ikan kerapu macan ukuran 7±0,5 cm.
Alat yang digunakan adalah sebagai berikut: kotak stirofom ukuran 100 x 50 x 34 cm
3
3.3 Prosedur Penelitian
, akuarium untuk wadah pemeliharaan, termometer, pH-meter, DO-meter dan spektrofotometer.
3.3.1 Puasa Ikan
Puasa ikan dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kemampuan ikan bisa bertahan hidup tanpa diberi makan. Penentuan puasa ikan dilakukan dengan
cara menyiapkan akuarium berukuran 40 × 32 × 30 cm
3
3.3.2 Tingkat Konsumsi Oksigen
yang telah dibersihkan dan dikeringkan selama 2 hari kemudian diisi air laut sebanyak 25 liter yang
diaerasi selama 2 hari lalu dimasukkan ikan kerapu macan berukuran 7±0,5 cm sebanyak 10 ekor. Pengamatan tingkah laku ikan serta kualitas air dilakukan
setiap hari. Kualitas air yang ukur yaitu oksigen terlarut dengan menggunakan DO-meter, suhu dengan termometer dan pH dengan pH-meter
Tingkat konsumsi oksigen TKO ditentukan bertujuan untuk menghitung kebutuhan oksigen benih ikan kerapu macan per jam, dengan cara menyiapkan 3
stoples bervolume 3 liter yang telah dibersihkan dan dikeringkan, kemudian diisi air bersalinitas 31 gl yang sebelumnya diaerasi selama 3 hari hingga jenuh. Ikan
uji yang digunakan berukuran 7±0,5 cm dengan bobot 4,02 gram. Ikan uji dipuasakan selama 2 hari kemudian dimasukkan kedalam wadah masing-masing
dengan kepadatan 3 ekor setiap wadah, kemudian ditutup dengan penutup plastik. Kandungan DO diukur setiap jam selama 4 jam dengan memasukkan
DO-meter ke dalam stoples.
3.3.3 Uji Letal Konsentrasi LC
50
-96 jam
Uji letal konsentrasi yang mematikan selama 96 jam LC
50
-96 jam dengan 4 tingkat konsentrasi termasuk kontrol. Untuk mendapatkan konsentrasi yang
dikehendaki dilakukan pengenceran dari larutan stok berkonsentrasi 1000 ppm, dengan menggunakan rumus: N
1
V
1
= N
2
V
2
3.3.4 Analisis Darah
. Selanjutnya konsentrasi tersebut ditetapkan sebagai konsentrasi perlakuan yaitu perlakuan A 60 ppm, B 80
ppm, C 100 ppm, D 120 ppm dan E 140 ppm, kemudian ikan yang sudah dipuasakan selama 48 jam dimasukkan kedalam media yang sudah mengandung
konsentrasi minyak sereh tertentu, lalu diamati tingkah laku ikan sampai ada perlakuan yang mengalami kematian 50.
Analisis darah yang dilakukan selama penelitian meliputi parameter : 1 Sel darah merah eritrosit
Penghitungan jumlah sel darah merah dilakukan pada ikan normal, pasca pengangkutan dan 7 hari setelah pemeliharaan. Pengamatan dan penghitungan
jumlah sel darah merah dilakukan berdasarkan prosedur dari Blaxhall dan Daisley 1973. Darah diambil dari ikan dengan menggunakan injeksi yang terlebih dahulu
telah diisi dengan cairan antikoagulan untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan kedalam ependorf, dan kemudian darah
dihisap dengan menggunakan pipet pencampur sampai dengan skala 0,5 dan ditambahkan dengan larutan hayems yang dihisap dengan menggunakan pipet
yang sama hingga mencapai skala 101. Setelah itu, pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang dan tetesan berikutnya
diteteskan kedalam hemositometer dan ditutup dengan kaca penutup. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak kecil yaitu pada sudut kiri atas, sudut kanan
atas, sudut kiri bawah, sudut kanan bawah dan pada bagian tengah. Jumlah sel darah merah yang terhitung dikonversikan dengan rumus :
Jumlah sel darah merah = ∑ sel darah merah terhitung x 10
6
selmm
3
2 Sel darah putih leukosit Penghitungan jumlah sel darah putih dilakukan pada ikan normal, pasca
pengangkutan dan 7 hari setelah pemeliharaan. Pengamatan dan penghitungan jumlah sel darah putih dilakukan berdasarkan prosedur dari Blaxhall dan Daisley
1973. Metode pengambilan darahnya sama dengan metode pengambilan darah merah. Darah dihisap dengan pipet pencampur sampai dengan skala 11.
Kemudian pipet digoyangkan hingga membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang, dan tetesan selanjutnya diteteskan diatas
hemositometer lalu ditutup dengan kaca penutup. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak besar.
Jumlah sel darah putih yang terhitung dikonversikan dengan rumus :
Jumlah sel darah putih = ∑ sel darah putih terhitung x 50 selmm
4 Kadar Hemoglobin Hb
3
3 Diferensiasi Leukosit
Dengan cara menghitung jumlah neutrofil, limfosit, monosit, trombosit dalam darah tersebut dengan pengamatan dilakukan sebanyak 10 lapang pandang
kemudian perhitungan dalam bentuk persentase
Pengukuran kadar hemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan hemoglobin dalam darah ke dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida dan
dinyatakan dalam persen Hb. Kadar HB dilakukan pada ikan normal, pasca pengangkutan dan 7 hari setelah pemeliharaan Anderson dan Swicki 1993.
Prosedur pengukuran kadar hemoglobin. Mula-mula darah diisap menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm
3
, kemudian dipindahkan ke dalam tabung Hb yang berisi HCl 0,1 N sampai skala 10 kuning. Didiamkan selama 3–5 menit agar Hb
bereaksi dengan HCl membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila sedikit demi sedikit hingga warnanya sama dengan
standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala lajur g yang menunjukkan banyaknya Hb dalam
gram setiap 100 ml darah dan dinyatakan dalam persentase Hb.
4. Glukosa Darah Pengukuran dilakukan untuk mengevaluasi tingkat stres pada ikan.
Prosedur pengukuran glukosa darah ikan yaitu: darah diambil dari ikan dengan menggunakan injeksi yang telah diisi dengan cairan antikoagulan untuk mencegah
terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan ke dalam tabung ependorf, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5
menit. Setelah terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang jernih di bagian atas, selanjutnya ambil 10 µ l lapisan plasma tambahkan kedalam
tabung reaksi berisi 1 ml regen glucose liquicolor selanjutnya dihomogenkan dengan menggunakan vortex, diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, baca
nilai absorban pada spektrofotometer dengan λ 500 nm. Kadar glukosa darah
diukur mengikuti Wedemeyer dan Yatsuke 1977 yaitu :
Absorban sampel Glukosa darah = x Konsentrasi standar
Absorban standar
Analisis Histopatologi
Histopatologi dilakukan pada ikan normal, pasca pengangkutan, dan setelah pemeliharaan 7 hari diukur di Laboratorium Kesehatan ikan Departemen
Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. Jaringan yang diamati adalah insang. Pengamatan dilakukan dengan membuat preparat histologi.
Prosedur pembuatan preparat histologi insang disajikan pada Lampiran 2.
3.3.6 Kualitas Air
Kategori