Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Metode Penelitian Analisis Data

BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 sampai Mei 2011 di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah neraca digital Preset Counter akurasi 0,01 gr, jarum gavage, blender, panci, hotplate Cimarec, beaker glass, bak bedah, dissecting set, incubator, freezer Sanyo, botol film, botol balsem, kaca arloji, aluminium foil, gelas ukur 1000ml, botol winkler, chamber, mikroskop Zeiss dan program Axiovision 14.0, counter, kamera digital Canon Ixus 95i, mikrotom, gelas objek, gelas penutup, kertas saring, kertas milimeter dan kertas label. Bahan yang digunakan adalah mencit jantan Mus musculus L., Testosterone Undekanoat TU buatan Schering AG Jerman, Biji Pepaya Carica papaya L., NaCl 0,95, Aquadest, Aquabidest, Castrol Oil, Alkohol 100, 96, 80, 70, 50, Larutan Bouin, pewarna Hematoxylin dan Eosin, Parafin, Canada balsem dan Xylol. Universitas Sumatera Utara

3.3 Metode Penelitian

Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap dengan 5 kelompok perlakuan P0 sd P4 dan 5 ulangan K0 sd K4 Tabel 1. Penentuan ulangan berdasarkan Rumus Federer dalam Ilyas 2001. Tabel 1. Model rancangan percobaan penelitian Minggu Kelompok 6 12 18 24 Kontrol K0 n=5 K1 n=5 K2 n=5 K3 n=5 K4 n=5 Perlakuan P0 n=5 P1 n=5 P2 n=5 P3 n=5 P4 n=5 Keterangan: K= Kontrol P= Perlakuan n=Ulangan 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan mencit jantan Mus musculus L. yang sehat dan fertil, berumur 8-11 minggu dengan berat badan 25-30 g sebanyak 50 ekor. Mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara- Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum Mangkoewidjojo Jhon, 1988. Kandang mencit dijaga kebersihannya dan diberi sirkulasi udara yang baik. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance dari Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara.

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya Carica papaya L.

Metode pembuatan ekstrak air biji pepaya Carica papaya L. dilakukan menurut Chinoy 1985 dalam Ilyas 2001. Disiapkan buah pepaya yang telah masak yang Universitas Sumatera Utara dikumpulkan dari Keluarahan Kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan, Komplek Adam Malik, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya diambil dan dicuci sampai bersih, kemudian dikeringkan dengan oven sampai kering pada suhu50 Celsius selama 3 hari. Biji yang telah kering kemudian dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ayakan tepung sehingga didapatkan 300 g serbuk halus biji pepaya. Biji pepaya yang telah menjadi serbuk kemudian dimasukkan dalam bejana berisi air dan dipanaskan di atas hotplate hingga mendidih. Air biji pepaya yang telah mendidih kemudian disaring dengan kertas saring. Hasil saringan dipanaskan kembali sampai diperoleh rendemen ekstrak kental berwarna coklat kehitaman. Sebanyak 30 g ekstrak tersebut kemudian dilarutkan dalam 500 mL aquabidestilata.

3.4.3 Uji Skrinning Fitokimia Biji Pepaya

Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne 1987, yaitu: a. Uji Flavanoid Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, dimasukkan sebanyak 3 g kedalam erlenmeyer yang berisi 100 mL methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl 3 , tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H 2 SO 4p dan tabung IV ditetesi NaOH 10. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya. b. Uji Alkaloid Biji pepaya yang telah kering kemudian dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya. Universitas Sumatera Utara Tanpa Perlakuan Pencekokan Ekstrak Air Biji Pepaya 30ekormencit jantanhari Injeksi TU 2,5mgekor interval 6 minggu c. Uji Steroid Biji pepaya kering dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL n-heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 1, tabung II ditetesi reagen Salkowsky H 2 SO 4 p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya. d. Uji Terpenoid Biji pepaya kering dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL kloroform. Kemudian dipanaskan dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 1, tabung II ditetesi reagen Salkowsky H 2 SO 4 p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.

3.4.4 Pemberian Kombinasi Air Biji Pepaya Carica papaya L. dan Testosteron Undekanoat TU

Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat TU dan Air Biji Pepaya Carica papaya L. diberikan dengan membandingkan dosis pada manusia. Perbandingan berat relawan 50 kg=50.000 g dengan mencit adalah 25 g adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 12000x500 mg TU = 0,25mg TU Moeloek et al., 1994; Ilyas, 2007. Sedangkan air biji pepaya 30 mg0,5mlhari25 g berat badan mencit Ilyas, 2001. Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan air biji pepaya setiap hari sampai 24 minggu Gambar 4. Gambar 3. Jadwal Kegiatan Pemberian Ekstrak Biji Pepaya + TU Minggu Minggu 6 Minggu 12 Minggu 18 Minggu 24 Kontrol Perlakuan Universitas Sumatera Utara

3.4.5 Pembuatan Preparat Histologis Testis dengan Metode Parafin

Setelah dilakukan pembedahan setiap 6 minggu, organ testis mencit diambil dan diamati morfologinya berat dan volume. Kemudian organ tersebut disiapkan untuk dibuat preparat histologi. Pembuatan preparat histologi menurut Suntoro 1983, dilakukan dengan metode parafin sebagai berikut: a. Fiksasi Testis mencit Mus musculus L. segar dibilas dengan larutan NaCl 0,95 kemudian difiksasi selama 1 malam dalam larutan BOUIN. b. Washing Pencucian Setelah difiksasi, testis dibilas dengan Alkohol 70 dan direndam selama 1 malam. c. Dehidrasi Dehidrasi dibilas dalam Alkohol berturut-turut dengan konsentrasi 70, 80, 96 dan 100 selama 1 jam dengan 2 kali pengulangan. d. Clearing Penjernihan Clearing dilakukan dengan merendam testis dalam Xylol selama 1 malam e. Infiltrasi Infiltrasi dilakukan dengan merendam testis dalam Xylol pada suhu 56 Celsius selama 1 jam di dalam inkubator. Dilanjutkan dengan merendam testis dalam Parafin cair bertingkat I, II dan III masing-masing pada suhu 56 f. Embedding Penanaman selama 1 jam. Embedding dilakukan dengan meletakkan testis pada cetakan yang telah dipersiapkan sebelumnya, lalu dituangkan parafin cair ke dalam cetakan tersebut dan diberi label. Dibiarkan hingga mengeras dan terbentuk blok-blok parafin. Blok parafin tersebut ditempelkan pada holder kayu persegi yang telah dipersiapkan. g. Cutting Pemotongan Blok parafin yang telah menempel pada holder kayu kemudian dipotong dengan mikrotom sehingga didapatkan pita-pita parafin. h. Attaching Penempelan Pita parafin yang didapat kemudian diletakkan pada objek glass dan direkatkan dengan cara dipanaskan di atas hotplate. i. Pewarnaan Pewarnaan sediaan testis dilakukan dengan beberapa tahap yaitu: Universitas Sumatera Utara - Deparafinasi, yaitu melarutkan parafin dengan cara mencelupkan objek dalam Xylol selama 15 menit. - Hidrasi dengan mencelupkan objek dalam Alkohol 100, 96, 80 dan 70 secara berturutan. - Pewarnaan, dilakukan dengan merendam objek dalam larutan pewarna Hematoxylin selama 3-7 menit, lalu dibilas dengan air mengalir selama 10 menit. Dilanjutkan dengan mencelupkan objek dalam Alkohol 30 dan 50 kemudian direndam dalam pewarna Eosin 0,5 selama 3 menit kemudian dibilas dengan air mengalir. Lalu objek dicelupkan dalam Alkohol bertingkat mulai 70, 80, 96 hingga 100 masing-masing selama 1 menit. Kemudian objek dikeringkan dan dicelupkan dalam Xylol. j. Mounting Sediaan yang telah diwarnai kemudian ditutup dengan canada balsam. 3.5 Parameter Pengamatan 3.5.1 Berat dan Volume Testis Morfologi Untuk menentukan berat testis dilakukan dengan menimbang berat testis bagian kiri dan kanan mencit dengan neraca digital akurasi 0,01 g. Kemudian berat kedua testis dirata-ratakan dan menjadi berat rata-rata testis masing-masing mencit. Sedangkan untuk menentukan volume testis mencit dilakukan dengan mengukur panjang dan lebar testis. Pengukuran dilakukan menggunakan kertas milimeter untuk menentukan panjang dan lebar testis, lalu dihitung melalui pendekatan rumus matematika. Rumus tersebut telah banyak digunakan oleh beberapa ahli primata untuk mengukur volume testis primata Bercovitch, 1989; Marson et al, 1991. Rumus tersebut adalah: TV = π.W 2 6 .L Keterangan: TV = Volume testis cm 3 W = Lebar testis L = Panjang testis π = 3,14 Universitas Sumatera Utara

3.5.2 Diameter Tubulus Seminiferus dan Ketebalan Lapisan Germinal Testis Histologi

Pengukuran diameter tubulus seminiferus dan luas lapisan sel-sel germinal testis dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 dan beserta program komputer Axiovision 4.0. Pengukuran yang dilakukan dipilih pada tubulus seminiferus yang berbentuk bulat atau mendekati bulat masing-masing tiga kali ulangan dan dirata-ratakan. Pengukuran tersebut dilakukan pada masing-masing preparat testis kanan dan kiri. Gambar 4. Skema Pengukuran Diameter Tubulus Seminiferus dan Ketebalan Lapisan Germinal 10x10. Ket: D=Diameter L=Luas Lapisan Germinal

3.6 Analisis Data

Data yang diperoleh dari setiap parameter variabel pengamatan dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif variabel dependen yang didapatkan, diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan variabel independen dengan Universitas Sumatera Utara bantuan program statistik komputer yaitu program SPSS release 16. Urutan uji diawali dengan uji normalitas, uji homogenitas, kemudian untuk pengamatan secara keseluruhan kelompok kontrol dan perlakuan keseluruhan, jika data yang diuji berdistribusi normal tetapi tidak homogen, maka data yang ditransformasi, jika data berbeda nyata pada taraf 5 p0,05, maka dilanjutkan dengan uji analisis Mann- Whitney. Jika dengan uji Mann-Whitney data berbeda nyata p0,05, pada kelompok kontrol atau perlakuan secara keseluruhan, maka dilanjutkan dengan uji analisis Friedman-Test dan Wilcoxon untuk melihat perbedaan kelompok kontrol atau perlakuan secara keseluruhan. Dan untuk melihat perbedaan 2 perlakuan kontrol dan perlakuan dilakukan dengan analisis uji T parametrik, untuk p0,05 atau Mann-Whitney non- parametrik, untuk p0,05. Sumber keragaman yang dianalisis untuk melihat pengaruh perlakuan dengan kontrol adalah perbedaan waktu pengamatan T dimulai dari minggu 0 hari pertama perlakuan sampai minggu 24. Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Biji Pepaya Carica papaya L.