Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU).

PENGHARGAAN

Puji dan syukur penulis sampaikan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan bimbinganNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul ”Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU)”. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Syaffrudin Ilyas, M.Biomed dan Ibu Masitta Tanjung, S.Si. M.Si. selaku dosen pembimbing I dan II yang telah banyak memberikan bimbingan, motivasi, arahan, serta dukungannya hingga selesainya skripsi ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Salomo Hutahaean, M.Si dan Ibu Dra. Elimasni, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.

Kepada Bapak Prof. Dr. Ing. Ternala Alexander Barus, M.Sc. selaku dosen penasehat akademik, Ibu Dr. Nursahara Pasaribu M. Sc selaku ketua Departemen Biologi, Bapak Drs. Kiki Nurtjahja, M. Sc selaku sekretaris Departemen Biologi. Bapak dan Ibu staf pengajar Departemen Biologi FMIPA USU. Ibu Roslina Ginting dan Bang Erwin selaku pegawai Departemen Biologi, serta Ibu Nurhasni Muluk selaku analis dan laboran di laboratorium Departemen Biologi yang telah memberikan bantuan kepada penulis.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ayahanda dan Ibunda yang sangat saya sayangi (M. Situmeang, S.pd dan Ernawati) yang telah mencurahkan segala bentuk kasih sayangnya baik dalam bentuk doa, perhatian, materi serta dukungan kepada penulis. Kepada abangku tercinta Bribtu. Boni Kiki, Andika, Amd kakak ipar Eva Marlina, S.Si serta adik dan Keponakanku tersayang Irma Juliana dan Opick serta teman terbaikku (My best Friend) Warysatul Ummah dan Imelvi Ombi yang telah sabar menemani penulis dan seluruh keluarga yang telah memberikan doa, perhatian, dukungan serta cinta dan kasih sayangnya kepada penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman seperjuangan Zulvia Maika Lestis, Dwi Putri Akarina, Gustika Maryati dan Desy Hikmatullah, Laura, Siti, Nasryanti, Ria Windi Lestari, Ayunita, Sari Dewi, Aini, Nisa, Nia, Eka, Else, Hotda, Jupentus, Desi, Eva, Chatrin, Anggun, Gustika, Elisabet, Jayana, dan seluruh stambuk 2007 ( Like The Ants ) yang tidak dapat disebut namanya satu per satu terima kasih untuk doa dan dukungannya. Kakak-kakak stambuk (Kak Desmina, Kak Hilda dan Kak Jane) dan adik-adik stambuk (Igun, Nanin, Zulfi, Ummi, dan Ahri), Kakek Basri dan Kakek Buah dan seluruh mahasiswa Biologi USU penulis

ucapkan terima kasih atas semua bantuan dan dukungan dan semua pihak yang telah terlibat yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis juga mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini. Demikianlah skripsi ini penulis sampaikan semoga bermanfaat bagi ilmu pengetahuan, amin.

Medan, Januari 2012

Penulis

Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron

Undekanoat (TU)

ABSTRAK

Ekstrak air biji pepaya dan testosteron undekanoat (TU) menyebabkan terjadinya penurunan kualitas dan kuantitas spermatozoa. Penurunan kualitas dan kuantitas spermatozoa dapat dipulihkan dengan pemberian Vitamin C. Penelitian “Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU)” memakai mencit jantan (Mus musculus L.) dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan 25-30 gram sebanyak 70 ekor yang dibagi kedalam 7 kelompok perlakuan dan 7 kelompok kontrol, masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa. Kelompok 1-5 (K0P0-K4P4) adalah kelompok kontrol atau perlakuan dengan pemberian ekstrak air biji pepaya 30mg/0.5ml/oral/hari/mencit dan testosteron undekanoat 0.1ml/mencit setiap 6 minggu sekali melalui intramuskular. Proses pemulihan dilakukan pada kelompok 5-7 (K4P4-K6P6) yang diberikan Vitamin C sebanyak 0,1mg/oral/hari/mencit. Pembedahan dilakukan setiap 6 minggu sekali melalui dislokasi leher. Pemeriksaan spermatozoa menggunakan kamar hitung Improved Neubauer dan mikroskop cahaya. Data yang diperoleh diuji secara statistik menggunakan SPSS release 13. Vitamin C dapat meningkatkan jumlah, motilitas, morfologi secara signifikan (p<0,05) serta viabilitas juga menunjukkan peningkatan yang tidak bermakna (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian Vitamin C 0.1mg/oral/hari/mencit dapat memulihkan keadaan spermatozoa baik secara kualitas maupun kuantitas.

Kata kunci: Vitamin C, Spermatozoa, Ekstrak air biji pepaya, Testosteron Undekanoat (TU)

Spermatozoa recovery Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat

(TU)

ABSTRACT

Water extract of papaya seeds and testosterone undecanoate (TU) resulted in decreased quality and quantity of spermatozoa. Decrease in the quality and quantity of spermatozoa can be restored by administering Vitamin C. The research "Recovery Spermatozoa Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat (TU)" using male mice (Mus musculus L.) grown fertile ± 3-month-old body weight 25-30 grams were 70 mices are divided into 7 treatment groups and 7 control groups, with five adult male mice of respectively. Groups 1-5 (K0P0-K4P4) is a control group or treatment by giving water extract of papaya seeds 30mg/0.5ml/oral/day/mice and testosterone undecanoate 0.1ml/mice every 6 weeks via intramuscular. The recovery process performed in group 5-7 are given Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice. Surgery is carried out every six weeks by the neck dislocation. Examination of spermatozoa using the Improved Neubauer counting room and light microscopy. The result obtained were tested statistically using SPSS release 13. Vitamin C increased number, motility, morphology of spermatozoa significantly (p<0,05) and viability of spermatozoa tend to increased unsignificantly (p>0,05). This suggests that administration of Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice that able to restore the state of spermatozoa both in quality and quantity.

Key words: Vitamin C, spermatozoa, the water extract of papaya seeds, Testosterone Undekanoat (TU)

DAFTAR ISI

Halaman

PERSETUJUAN i

PERNYATAAN ii

PENGHARGAAN iii

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

DAFTAR ISI vii

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR TABEL x

DAFTAR LAMPIRAN xi

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 2

1.3 Tujuan Penelitian 3

1.4 Hipotesis Penelitian 3

1.5 Manfaat Penelitian 4

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.2 Vitamin C (Asam askorbat) 5

2.2Tanaman Pepaya (Carica papaya L.) 6

2.3 Testosteron Undekanoat (TU) 8

2.4 Organ Reproduksi Jantan 9

2.4.1 Testis 10

2.4.2 Epididimis 10

2.4.3 Vas Deferens 10

2.4.4 Kelenjar Aksesoris 10

2.5 Spermatogenesis 10

2.6 Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) 11

2.6.1 Morfologi 11

2.6.2 Viabilitas 12

2.6.3 Motilitas 13

III. BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat 14

3.2 Alat dan Bahan 14

3.3 Rancangan Penelitian 14

3.4 Pelaksanaan Penelitian 15

3.4.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan 15

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) 15 3.4.3 Uji Skrining Biji Pepaya 16

3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) 17 dan Ekstrak Air Biji (Carica papaya L.)

3.4.5 Pemberian Vitamin C 18

3.5 Parameter Pengamatan 19

3.5.1 Menghitung Jumlah Sperma 19

3.5.2 Pengamatan Morfologi 19

3.5.3 Pengamatan Viabilitas 20 3.5.4 Pengamatan Motilitas 20

3.6 Analisis Data 21

IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Jumlah Spermatozoa 22

4.2 Motilitas Spermatozoa 25

4.3 Viabilitas Spermatozoa 27

4.4 Morfologi Spermatozoa 29

V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 32

5.2 Saran 32

DAFTAR GAMBAR

No. Judul Halaman

1. Struktur vitamin C (Asam askorbat ) 6

2. Tanaman pepaya (Carica papaya L.) 7

3. Rumus bangun testosteron undekanoat (TU) 8

4. Bentuk-bentuk sperma abnormal pada tikus 12

5. Jadwal kegiatan pemberian TU+ekstrak air biji pepaya selama 36 18 minggu.

6. Kamar hitung improved neubauer 19 7. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok kontrol 22 8. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok perlakuan 23 9. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok kontrol dan perlakuan 24 10. Grafik konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok perlakuan 25 11. Grafik konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol 26 dan perlakuan

12. Grafik konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol 28 dan perlakuan

13. Grafik konsentrasi morfologi spermatozoa mencit kelompok perlakuan 29 14. Grafik konsentrasi morfologi spermatozoa mencit kelompok kontrol 30 dan perlakuan

DAFTAR TABEL

No. Judul Halaman

DAFTAR LAMPIRAN

No. Judul Halaman

1. Data rataan jumlah spermatozoa mencit 36

2. Data rataan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit 42 3. Data rataan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit 48 4. Data rataan konsentrasi morfologi spermatozoa mencit 52

5. Gambar alat dan bahan 57

6. Gambar hasil pengamatan 58 7. Prosedur pembuatan ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) 59 8. Prosedur uji skrining fitokomia biji pepaya (Carica papaya L.) 60 9. Prosedur pengamatan spermatozoa mencit 62

10. Prosedur penyediaan vitamin C 64

11. Hasil identifikasi herbarium medanense (MEDA) 65

12. Hasil uji skrining fitokimia 66

PERSETUJUAN

Diluluskan di

Medan, Januari 2012

Komisi Pembimbing :

Pembimbing 2 Pembimbing 1

Masitta Tanjung, S.Si. M.Si. Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed NIP.19710910 200012 2 001 NIP. 19660209 199203 1 003

Diketahui/Disetujui oleh

Departemen Biologi FMIPA USU Ketua,

Dr. Nursahara Pasaribu, M.Sc. NIP. 19630123 199003 2 00

Judul : PEMULIHAN SPERMATOZOA MENCIT (Mus musculus L.)DENGAN VITAMIN C SETELAH PEMBERIAN EKSTRAK AIR BIJI PEPAYA (Carica papaya L.) DAN TESTOSTERON UNDEKANOAT (TU)

Kategori : SKRIPSI

Nama : MARIA LESTARI

Nomor Induk Mahasiswa : 070805007

Program Studi : SARJANA (S1)BIOLOGI Departemen : BIOLOGI

Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

PERNYATAAN

PEMULIHAN SPERMATOZOA MENCIT (Mus musculus L.) DENGAN VITAMIN C SETELAH PEMBERIAN EKSTRAK AIR BIJI PEPAYA (Carica

papaya L.) DAN TESTOSTERON UNDEKANOAT (TU)

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Januari 2012

MARIA LESTARI 070805007

PENGHARGAAN

Puji dan syukur penulis sampaikan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan bimbinganNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul ”Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU)”. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Syaffrudin Ilyas, M.Biomed dan Ibu Masitta Tanjung, S.Si. M.Si. selaku dosen pembimbing I dan II yang telah banyak memberikan bimbingan, motivasi, arahan, serta dukungannya hingga selesainya skripsi ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Salomo Hutahaean, M.Si dan Ibu Dra. Elimasni, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.

Kepada Bapak Prof. Dr. Ing. Ternala Alexander Barus, M.Sc. selaku dosen penasehat akademik, Ibu Dr. Nursahara Pasaribu M. Sc selaku ketua Departemen Biologi, Bapak Drs. Kiki Nurtjahja, M. Sc selaku sekretaris Departemen Biologi. Bapak dan Ibu staf pengajar Departemen Biologi FMIPA USU. Ibu Roslina Ginting dan Bang Erwin selaku pegawai Departemen Biologi, serta Ibu Nurhasni Muluk selaku analis dan laboran di laboratorium Departemen Biologi yang telah memberikan bantuan kepada penulis.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ayahanda dan Ibunda yang sangat saya sayangi (M. Situmeang, S.pd dan Ernawati) yang telah mencurahkan segala bentuk kasih sayangnya baik dalam bentuk doa, perhatian, materi serta dukungan kepada penulis. Kepada abangku tercinta Bribtu. Boni Kiki, Andika, Amd kakak ipar Eva Marlina, S.Si serta adik dan Keponakanku tersayang Irma Juliana dan Opick serta teman terbaikku (My best Friend) Warysatul Ummah dan Imelvi Ombi yang telah sabar menemani penulis dan seluruh keluarga yang telah memberikan doa, perhatian, dukungan serta cinta dan kasih sayangnya kepada penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman seperjuangan Zulvia Maika Lestis, Dwi Putri Akarina, Gustika Maryati dan Desy Hikmatullah, Laura, Siti, Nasryanti, Ria Windi Lestari, Ayunita, Sari Dewi, Aini, Nisa, Nia, Eka, Else, Hotda, Jupentus, Desi, Eva, Chatrin, Anggun, Gustika, Elisabet, Jayana, dan seluruh stambuk 2007 ( Like The Ants ) yang tidak dapat disebut namanya satu per satu terima kasih untuk doa dan dukungannya. Kakak-kakak stambuk (Kak Desmina, Kak Hilda dan Kak Jane) dan adik-adik stambuk (Igun, Nanin, Zulfi, Ummi, dan Ahri), Kakek Basri dan Kakek Buah dan seluruh mahasiswa Biologi USU penulis ucapkan terima kasih atas semua bantuan dan dukungan dan semua pihak yang telah terlibat yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis juga mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini. Demikianlah skripsi ini penulis sampaikan semoga bermanfaat bagi ilmu pengetahuan, amin.

Medan, Januari 2012

Penulis

Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron

Undekanoat (TU)

ABSTRAK

Ekstrak air biji pepaya dan testosteron undekanoat (TU) menyebabkan terjadinya penurunan kualitas dan kuantitas spermatozoa. Penurunan kualitas dan kuantitas spermatozoa dapat dipulihkan dengan pemberian Vitamin C. Penelitian “Pemulihan Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) dengan Vitamin C setelah Pemberian Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU)” memakai mencit jantan (Mus musculus L.) dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan 25-30 gram sebanyak 70 ekor yang dibagi kedalam 7 kelompok perlakuan dan 7 kelompok kontrol, masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa. Kelompok 1-5 (K0P0-K4P4) adalah kelompok kontrol atau perlakuan dengan pemberian ekstrak air biji pepaya 30mg/0.5ml/oral/hari/mencit dan testosteron undekanoat 0.1ml/mencit setiap 6 minggu sekali melalui intramuskular. Proses pemulihan dilakukan pada kelompok 5-7 (K4P4-K6P6) yang diberikan Vitamin C sebanyak 0,1mg/oral/hari/mencit. Pembedahan dilakukan setiap 6 minggu sekali melalui dislokasi leher. Pemeriksaan spermatozoa menggunakan kamar hitung Improved Neubauer dan mikroskop cahaya. Data yang diperoleh diuji secara statistik menggunakan SPSS release 13. Vitamin C dapat meningkatkan jumlah, motilitas, morfologi secara signifikan (p<0,05) serta viabilitas juga menunjukkan peningkatan yang tidak bermakna (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian Vitamin C 0.1mg/oral/hari/mencit dapat memulihkan keadaan spermatozoa baik secara kualitas maupun kuantitas.

Kata kunci: Vitamin C, Spermatozoa, Ekstrak air biji pepaya, Testosteron Undekanoat (TU)

Spermatozoa recovery Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat

(TU)

ABSTRACT

Water extract of papaya seeds and testosterone undecanoate (TU) resulted in decreased quality and quantity of spermatozoa. Decrease in the quality and quantity of spermatozoa can be restored by administering Vitamin C. The research "Recovery Spermatozoa Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat (TU)" using male mice (Mus musculus L.) grown fertile ± 3-month-old body weight 25-30 grams were 70 mices are divided into 7 treatment groups and 7 control groups, with five adult male mice of respectively. Groups 1-5 (K0P0-K4P4) is a control group or treatment by giving water extract of papaya seeds 30mg/0.5ml/oral/day/mice and testosterone undecanoate 0.1ml/mice every 6 weeks via intramuscular. The recovery process performed in group 5-7 are given Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice. Surgery is carried out every six weeks by the neck dislocation. Examination of spermatozoa using the Improved Neubauer counting room and light microscopy. The result obtained were tested statistically using SPSS release 13. Vitamin C increased number, motility, morphology of spermatozoa significantly (p<0,05) and viability of spermatozoa tend to increased unsignificantly (p>0,05). This suggests that administration of Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice that able to restore the state of spermatozoa both in quality and quantity.

Key words: Vitamin C, spermatozoa, the water extract of papaya seeds, Testosterone Undekanoat (TU)

DAFTAR ISI

Halaman

PERSETUJUAN i

PERNYATAAN ii

PENGHARGAAN iii

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

DAFTAR ISI vii

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR TABEL x

DAFTAR LAMPIRAN xi

III.PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 2

1.3 Tujuan Penelitian 3

1.4 Hipotesis Penelitian 3

1.5 Manfaat Penelitian 4

IV.TINJAUAN PUSTAKA

2.2 Vitamin C (Asam askorbat) 5

2.3Tanaman Pepaya (Carica papaya L.) 6

2.3 Testosteron Undekanoat (TU) 8

2.4 Organ Reproduksi Jantan 9

2.4.1 Testis 10

2.4.2 Epididimis 10

2.4.3 Vas Deferens 10

2.4.4 Kelenjar Aksesoris 10

2.5 Spermatogenesis 10

2.6 Spermatozoa Mencit (Mus musculus L.) 11

2.6.1 Morfologi 11

2.6.2 Viabilitas 12

2.6.3 Motilitas 13

III. BAHAN DAN METODE

3.5 Waktu dan Tempat 14

3.6 Alat dan Bahan 14

3.7 Rancangan Penelitian 14

3.8 Pelaksanaan Penelitian 15

3.4.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan 15

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) 15 3.4.3 Uji Skrining Biji Pepaya 16

3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) 17 dan Ekstrak Air Biji (Carica papaya L.)

3.4.5 Pemberian Vitamin C 18

3.5 Parameter Pengamatan 19

3.5.1 Menghitung Jumlah Sperma 19

3.5.2 Pengamatan Morfologi 19

3.5.3 Pengamatan Viabilitas 20 3.5.4 Pengamatan Motilitas 20

3.6 Analisis Data 21

IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Jumlah Spermatozoa 22

4.2 Motilitas Spermatozoa 25

4.3 Viabilitas Spermatozoa 27

4.4 Morfologi Spermatozoa 29

V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 32

5.2 Saran 32

DAFTAR GAMBAR

No. Judul Halaman

4. Struktur vitamin C (Asam askorbat ) 6

5. Tanaman pepaya (Carica papaya L.) 7

6. Rumus bangun testosteron undekanoat (TU) 8

4. Bentuk-bentuk sperma abnormal pada tikus 12

5. Jadwal kegiatan pemberian TU+ekstrak air biji pepaya selama 36 18 minggu.

6. Kamar hitung improved neubauer 19 7. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok kontrol 22 8. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok perlakuan 23 9. Grafik jumlah spermatozoa mencit kelompok kontrol dan perlakuan 24 10. Grafik konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok perlakuan 25 11. Grafik konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol 26 dan perlakuan

12. Grafik konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol 28 dan perlakuan

13. Grafik konsentrasi morfologi spermatozoa mencit kelompok perlakuan 29 14. Grafik konsentrasi morfologi spermatozoa mencit kelompok kontrol 30 dan perlakuan

DAFTAR TABEL

No. Judul Halaman

DAFTAR LAMPIRAN

No. Judul Halaman

10. Data rataan jumlah spermatozoa mencit 36

11. Data rataan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit 42 12. Data rataan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit 48 13. Data rataan konsentrasi morfologi spermatozoa mencit 52

14. Gambar alat dan bahan 57

15. Gambar hasil pengamatan 58 16. Prosedur pembuatan ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) 59 17. Prosedur uji skrining fitokomia biji pepaya (Carica papaya L.) 60 18. Prosedur pengamatan spermatozoa mencit 62

10. Prosedur penyediaan vitamin C 64

11. Hasil identifikasi herbarium medanense (MEDA) 65

12. Hasil uji skrining fitokimia 66

Spermatozoa recovery Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat

(TU)

ABSTRACT

Water extract of papaya seeds and testosterone undecanoate (TU) resulted in decreased quality and quantity of spermatozoa. Decrease in the quality and quantity of spermatozoa can be restored by administering Vitamin C. The research "Recovery Spermatozoa Mice (Mus musculus L.) with Vitamin C after Giving Water Seed Extract Papaya (Carica papaya L.) and Testosterone Undekanoat (TU)" using male mice (Mus musculus L.) grown fertile ± 3-month-old body weight 25-30 grams were 70 mices are divided into 7 treatment groups and 7 control groups, with five adult male mice of respectively. Groups 1-5 (K0P0-K4P4) is a control group or treatment by giving water extract of papaya seeds 30mg/0.5ml/oral/day/mice and testosterone undecanoate 0.1ml/mice every 6 weeks via intramuscular. The recovery process performed in group 5-7 are given Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice. Surgery is carried out every six weeks by the neck dislocation. Examination of spermatozoa using the Improved Neubauer counting room and light microscopy. The result obtained were tested statistically using SPSS release 13. Vitamin C increased number, motility, morphology of spermatozoa significantly (p<0,05) and viability of spermatozoa tend to increased unsignificantly (p>0,05). This suggests that administration of Vitamin C 0.1 mg/oral/day/mice that able to restore the state of spermatozoa both in quality and quantity.

Key words: Vitamin C, spermatozoa, the water extract of papaya seeds, Testosterone Undekanoat (TU)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Jumlah penduduk yang mengalami peningkatan yang cukup pesat saat ini, sangat dipengaruhi oleh penerapan keluarga berencana (KB). Pada kenyataannya program keluarga berencana masih didominasi oleh wanita sedangkan kaum pria belum memberikan partisipasinya. Peranan kaum pria dalam program KB sangat penting karena biasanya pria lebih dominan dalam menentukan kebijakan dalam keluarga. Keberhasilan penerapan kontrasepsi untuk wanita bukan berarti pria tidak ambil bagian dalam program KB dengan salah satu alat kontrasepsi yang efektif untuk kaum pria (Satriyasa &Pangkahila, 2010).

Secara garis besar kerja obat kontrasepsi/KB terhadap sistem reproduksi pada pria dapat digolongkan berdasarkan tiga lokasi yakni, pretestikuler, testikuler, dan protestikuler. Cara protestikuler adalah cara yang dapat menghambat pematangan spermatozoa setelah berada dalam epididimis, diperkirakan ekstrak biji pepaya dapat sebagai pengatur fertilitas atau kesuburan secara postestikuler yang potensial pada tikus jantan, karena ekstrak tersebut memiliki efek membunuh spermatozoa matang di epididimis (Chinoy, 1985 dalam Amir, 1992).

Ekstrak biji pepaya telah diketahui juga memiliki efek antifertilitas dan menyebabkan keguguran (abortivum) pada wanita yang hamil. Hal ini mungkin disebabkan oleh zat yang terdapat pada biji pepaya mempengaruhi hormon reproduksi wanita. Penelitian kualitatif yang dilakukan oleh Usaman dkk (1980) menunjukan bahwa biji Carica papaya L. memiliki senyawa glukosida yang bersifat toksik. Meskipun demikian, biji pepaya tersebut dapat digunakan sebagai bahan dasar obat tradisional sebagai antifertilitas ( Ilyas, 2001).

Secara fungsional epididimis sangat tergantung pada hormon testosteron se bagaimana diketahui, testosteron diperlukan untuk daya hidup spermatozoa dalam epididimis (Arsyad, 1986). Proses pematangan sperma sangat tergantung pada hormon androgen (Tadjudin, 1988). Salah satu hormon androgen yakni testosteron. Testosteron adalah hormon androgen yang dihasilkan oleh sel interstitial atau sel leydig. Hormon ini berperan dalam mengontrol proses spermatogenesis pada pembelahan meiosis dan proses spermiogenesis. Kebutuhan epididimis akan androgen untuk pematangan spermatozoa, lebih tinggi daripada testis, hingga penurunan kadar androgen sedikit saja dapat menggangu proses pematangan spermatozoa dalam epididimis, akan tetapi tidak menggangu spermatogenesis (Amir, 1992).

Selain hormon androgen asam askorbat juga memberikan efek baik kepada integritas dari struktur tubular maupun terhadap fungsi sperma. Pada tubular dapat diasumsikan bahwa asam askorbat dibutuhkan untuk sekresi dan pemeliharaan lapisan kolagen (Siregar, 2009). Akmal et al., (2006) penelitian terhadap pasien infertil dengan keadaan oligosperma, motilitas sperma rendah dan jumlah sperma bentuk normal yang rendah, setelah diberikan suplemen vitamin C 1000 mg/hari selama 2 bulan, memperlihatkan peningkatan jumlah sperma, motilitas sperma dan jumlah sperma yang morfologinya normal. Defisiensi asam askorbat telah lama dihubungkan dengan jumlah sperma yang rendah, peningkatan jumlah sperma yang abnormal, mengurangi motilitas dan aglutinasi. Pada beberapa penelitian telah dibuktikan bahwa asupan asam askorbat dapat memperbaiki kualitas sperma. Efek yang menguntungkan dari asam askorbat ini adalah hasil dari pemecahan radikal bebas yang sering timbul akibat polusi lingkungan dan metabolisme selular yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif. Asam askorbat atau vitamin C digunakan sebagai komponen pemulihan kualitas dan kuantitas sperma (Siregar, 2009).

1.2 Permasalahan

Jumlah penduduk yang mengalami peningkatan dilatarbelakangi oleh kurangnya partisipasi pihak pria dalam penerapan keluarga berencana (KB). Partisipasi yang harus diberikan kaum pria adalah penggunaan alat kontrasepsi. Saat ini diperkirakan

pemberian ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) dapat menjadi salah satu alat kontrasepsi atau antifertilitas, dengan kata lain dapat membunuh spermatozoa mencit (Mus musculus L.) yang juga tidak terlepas dari salah satu kerja hormon androgen yakni testosteron yang mengendalikan proses spermatogenesis. Seiring dengan hal tersebut pemberian asupan Vitamin C juga diduga dapat memulihkan kembali keadaan sperma baik secara kualitas dan kuantitas. Oleh karena itu peneliti ingin membuktikan apakah Vitamin C dapat memulihkan spermatozoa mencit (Mus musculus L.) setelah pemberian ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) Medan dan Testosteron Undekanoat (TU).

1.2Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian Vitamin C terhadap pemulihan spermatozoa mencit (Mus musculus L.) baik kualitas dan kuantitasnya setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.).

1.3Hipotesis Penelitian

a. Pemberian vitamin C, pada mencit (Mus musculus L.) dapat mempercepat pemulihan jumlah spermatozoa setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

b. Pemberian vitamin C, pada mencit (Mus musculus L.) dapat mempercepat pemulihan morfologi spermatozoa setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

c. Pemberian vitamin C, pada mencit (Mus musculus L.) dapat mempercepat pemulihan motilitas spermatozoa setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

d. Pemberian vitamin C, pada mencit (Mus musculus L.) dapat mempercepat pemulihan viabilitas spermatozoa setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

1.4Manfaat penelitian

Manfaat yang diperoleh setelah pelaksanaan penelitian adalah:

a. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi data awal untuk pembuatan alat kontrasepsi

b. Penelitian ini diharapkan dapat memberi masukan kepada masyarakat bahwa pemberian vitamin C dapat memberikan efek terhadap pemulihan spermatozoa mencit (Mus musculus L.)

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Vitamin C (Asam askorbat)

Asam askorbat adalah vitamin yang dapat larut dalam air dan sangat penting untuk biosintesis kolagen, karnitin, dan berbagai neurotransmitter. Kebanyakan tumbuh-tumbuhan dan hewan dapat mensintesis asam askorbat untuk kebutuhannya sendiri. Akan tetapi manusia dan golongan primata lainnya tidak dapat mensintesa asam askorbat disebabkan karena tidak memiliki enzim gulunolactone oxidase, begitu juga dengan marmut dan kelelawar pemakan buah. Oleh sebab itu asam askorbat harus disuplai dari luar tubuh terutama dari buah, sayuran, atau tablet suplemen Vitamin C. Banyak keuntungan di bidang kesehatan yang didapat dari fungsi askorbat, seperti fungsinya sebagai antioksidan, anti atherogenik, immunomodulator dan mencegah flu (Naidu, 2003). Akan tetapi untuk dapat berfungsi dengan baik sebagai antioksidan, maka kadar asam askorbat ini harus terjaga agar tetap dalam kadar yang relatif tinggi di dalam tubuh (Yi li, 2007 dalam Siregar, 2009).

Antioksidan adalah substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif (Iswara, 2009).

Antioksidan yang berupa mikronutrien dikenal tiga yang utama, yaitu : B-karoten, Vitamin C dan Vitamin E. B-caroten merupakan scavengers (pengumpul) oksigen tunggal, Vitamin C pemulung superoksida dan radikal bebas yang lain, sedangkan Vitamin E merupakan pemutus rantai peroksida lemak pada membran dan

Low Density Lipoprotein. Vitamin E yang larut dalam lemak merupakan antioksidan yang melindungi Poly Unsaturated Faty Acids (PUFAs) dan komponen sel serta membran sel dari oksidasi oleh radikal bebas (Iswara, 2009).

Asam askorbat adalah 6 atom karbon lakton yang disintesis dari glukosa yang terdapat dalam liver. Nama kimia dari asam askorbat 2-oxo-threo-hexono-1,4-lactone-2,3-enediol. Bentuk utama dari asam askorbat yang dinamakan adalah L-ascorbic dan dehydroL-ascorbic acid (Naidu, 2003).

Gambar 2.1 Struktur Vitamin C (Asam askorbat) (Hart, 1987)

Stress oksidatif dapat dibatasi dengan menggunakan antioksidan berupa suplemen Vitamin C dan E. Vitamin C dapat menetralisir radikal hidroksil, superoksid, dan hidrogen peroksida dan mencegah aglutinasi sperma. Vitamin C sedikit jumlahnya pada cairan semen laki-laki infertil. Vitamin C dapat meningkatkan jumlah sperma in vivo pada laki-laki infertil dengan dosis oral sekitar 200-1000mg/hari (Agarwal et al., 2005).

2.2 Tanaman Pepaya (Carica papaya L.)

Tanaman pepaya termasuk tanaman perdu yang sekulen yang secara sistematik dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Gambar 2.2 Tanaman pepaya Carica papaya L. Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta Kelas : Dicotyledoneae Ordo : Cistales

Famili : Caricaceae Genus : Carica

Spesies : Carica papaya L. (Tjitrosoepomo, 2004)

Biji pepaya yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari buah yang berbentuk agak lonjong dan memanjang, memiliki ukuran yang bervariasi. Daunnya merupakan daun tunggal, berukuran besar, dan bercangap. Tangkai daun panjang dan berongga. Bunganya terdiri dari tiga jenis, yaitu bunga jantan, bunga betina, dan bunga sempurna. Pada awalnya tanaman Carica papaya L. ini merupakan tanaman yang berasal dari Amerika tropis. Pusat penyebaran tanaman diduga berada di daerah sekitar Mexiko bagian selatan dan Nikaragua. Batang, daun dan buah pepaya mengandung getah bewarna putih. Getah ini mengandung suatu enzim pemecah protein atau enzim proteolitik yang disebut papain (Kalie, 1996).

Dalam penelitian ini salah satu bagian organ dari tanaman pepaya ini yakni biji yang akan dimanfaatkan sebagai bahan utama pembuatan ekstrak. Menurut Kloppenburg 1915, dalam Amir (1992), biji pepaya jangan sekali-kali termakan orang yang sedang hamil muda karena dapat mengakibatkan keguguran. Orang yang keguguran akibat memakan biji pepaya ini biasanya sulit hamil lagi karena adanya pengeringan rahim akibat masuknya enzim proteolitik seperti papain, chymopapain A,

chymopapain B, dan peptidase pepaya. Disamping enzim proteolitik, biji pepaya juga mengandung kandungan kimia yang lain seperti : 25% atau lebih minyak campuran, 26,2% lemak, 24,3% protein, 17% serat, 15,5% karbohidrat, 8,8% abu, dan 8,2% air. Ekstrak encer biji pepaya dapat digunakan untuk kontrasepsi yang berfungsi sebagai anti fertilitas (Amir, 1992).

Secara tradisional biji pepaya dapat dimanfaatkan sebagai obat cacing gelang, gangguan pencernaan, penyakit kulit, kontrasepsi pria, bahan baku obat masuk angin dll. Minyak biji pepaya kuning diketahui mengandung 71,60% asam oleat, 15,13% asam palmitat, 7,68% asam linoleat, 3,60% asam stearat dan asam-asam lemak lain dalam jumlah sedikit atau terbatas. Selain mengandung asam lemak biji pepaya diketahui mengandung senyawa kimia lain seperti golongan fenol, alkaloid dan saponin (Sukadana et al., 2008).

2.3 Testosteron Undekanoat

Testosteron Undekanoat yang dikembangkan untuk kontrasepsi pria digunakan dalam bentuk injeksi (liquid). Sediaan tersebut diberikan dengan cara injeksi secara intramuskular. Ada juga TU dalam bentuk powder yang kadang-kadang dibungkus dengan kapsul. Testosteron Undekanoat dihasilkan melalui esterifikasi testosteron

alami pada posisi 17β. Testosteron Undekanoat ini merupakan steroid dengan 19 atom

karbon dengan rumus kimia C19H28O2 serta nama kimianya adalah 17

beta-hydroxyandrost-4-en-3-one (Goddman & Gilman, 1980).

Gambar 2.3 Rumus Bangun Testosteron Undekanoat (TU) (Goodman&Gilman1980)

O

C-(CH

2

)

9

-CH

3

O

O

Tujuan utama dari pemberian testosteron adalah mempertahankan tingginya tingkat serum testosteron jangka panjang pada pria yang ikut dalam kontrasepsi pria. Hal ini bertujuan untuk menekan spermatogenesis sehingga terjadi azoospermia atau oligozoospermia berat yang berlangsung lebih lama namun bersifat aman, efektif, reversibel dan aseptibel (Ilyas, 2008).

Adanya fakta bahwa testosteron sendiri melebihi dari metabolitnya dalam mengatur spermatogenesis telah dipastikan oleh penemuan reseptor khusus testosteron di sel-sel sertoli. Hormon gonadotropin yang dramatis pada waktu pubertas menstimulasi pertumbuhan testis. Testosteron undekanoat mempunyai efek positif pada pengobatan oligozoospermia. Kadar FSH normal dan kadar testosteron sedikitnya di bawah normal merupakan syarat untuk suatu respon yang efektif. Sebagai suatu akibat dari pemakaian testosteron undekanoat densitas meningkat dan kualitas sperma membaik. Dalam hal motilitas sperma tidak ada hasil yang mencurigakan yang ditemukan. Tetapi adanya fakta bahwa efektivitas testosteron undekanoat telah ditunjukkan dalam studi dibawah kondisi buta ganda pada pasien yang diseleksi dengan teliti menyokong hipotesis bahwa pemakaian testosteron adalah suatu usaha yang berguna dalam infertilitas pria (Bremer, 1959).

2.4 Organ Reproduksi Mencit jantan

Organ reproduksi mencit jantan (Mus musculus L.) terdiri dari: testis, epididimis, Vas deferens, kelenjar aksesoris dan bebarapa organ pendukung lainnya. Berikut dijelas kan beberapa organ utama reproduksi mencit.

2.4.1 Testis

Setiap testis ditutupi dengan jaringan ikat fibrosa, tunika albuginea, bagian tipisnya atau septa akan memasuki organ untuk membelah menjadi lobus yang mengandung beberapa tubulus disebut tubulus seminiferus. Bagian tunika memasuki testis dan bagian arteri testiskuler yang masuk disebut sebagai hilus. Epitel tubulus seminiferus berada tepat di bawah membran basalis yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrosa

yang tipis. Antara tubulus adalah stroma interstitial, terdiri atas gumpalan sel leydig ataupun sel sertoli dan kaya akan darah dan cairan limfe (Rugh, 1968).

2.4.2 Epididimis

Epididimis terletak pada bagian dorsolateral testis, merupakan suatu struktur memanjang dari bagian atas sampai bagian bawah testis. Organ ini terdiri dari bagian kaput, korpus dan kauda epididimis (Rugh, 1968). Epitel epididimis memiliki dua fungsi. Pertama mensekresi plasma epididimis yang bersifat kompleks tempat sperma tersuspensikan dan mengalami pematangan. Kedua, mengabsobsi kembali cairan testikuler yang mengankut sperma dari tubulus seminiferus dan sperma yang sudah rusak (Rugh, 1968).

2.4.3 Vas deferens

Vas deferens merupakan suatu saluran yang menghubungkan epididimis dan uretra. Letak vas deferens dimulai dari ujung kauda epididimis yang ada dalam kantung skrotum , lalu naik ke bagian atas lipat paha. Sebelum masuk ke uretra, vas deferens ini bergabung terlebih dahulu dengan slauran ekskresi vesika seminalis membentuk duktus ejakulatoris. Pada saat ejakulasi sperma dari epididimis diangkut melalui vas deferens dengan suatu seri kontraksi yang dikontrol oleh saraf (Rugh, 1968).

2.4.4 Kelenjar Aksesoris

Kelenjar-kelenjar tambahan menghasilkan plasma semen yang memungkinkan sperma dapat bergerak aktif dan hidup untuk waktu tertentu. Kelenjar tambahan tersebut adalah kelenjar bulbourethra, kelenjar prostad dan vesika seminalis (Rugh, 1968). 2.5 Spermatogenesis

Sel germinal primordial mencit jantan muncul sekitar 8 hari kehamilan, dengan jumlah hanya 100, yang merupakan awal dari jutaan sperma yang akan diproduksi dan masih berada di daerah ekstra gonad. Karena sel germinal kaya akan alkalin fosfatase untuk mensuplai energi pergerakannya melalui jaringan embrio, maka sel germinal

dapat dikenal dengan teknik pewarnaan. Pada hari ke 9 dan 10 kehamilan sebagian mengalami degenerasi dan sebagian lain mengalami proliferasi dan bahkan bergerak (pada hari ke 11 dan 12) ke daerah genital. Pada saat jumlahnya mencapai sekitar 5000 dan identifikasi testis dapat dilakukan. Proses proliferasi dan differensiasi berlangsung di daerah medulla testis. Pada kasus steril, kehilangan sel germinal berlangsung selama perjalanan dari bagian ekstra gonad menuju daerah genetalia. Menuju akhir masa fetus, aktivitas mitosis sel germinal primordial dalam bagian genetalia berkurang dan beberapa sel mulai degenerasi menjelang hari ke-19 kehamilan. Tidak berapa lama setelah kelahiran, sel tampak lebih besar, yaitu spermatogonia. Setelah itu akan ada spermatogonia dalam testis mencit sepanjang hidupnya. Ada 3 jenis spermatogonia: tipe A, tipe intermediet dan tipe B (Rugh, 1968).

2.6 Spermatozoa mencit (Mus musculus L.)

Spermatozoa adalah sel kelamin (gamet) yang diproduksi di dalam tubulus seminiferus melalui proses spermatogenesis, dan bersama-sama dengan plasma semen akan dikeluarkan melalui sel kelamin jantan.

Bentuk spermatozoa abnormal dapat diklasifikasikan berdasarkan bentuk kepala dan ekornya. Menurut Washington et al., (1983), bentuk sperma abnormal pada tikus terdiri dari bentuk kepala seperti pisang, bentuk kepala tidak beraturan (amorphous), bentuk kepala terlalu membengkok dan lipatan-lipatan ekor yang abnormal.

2.6.1 Morfologi Spermatozoa mencit (Mus musculus L.)

Kepala spermatozoa terdiri atas sel berinti padat dengan hanya sedikit sitoplasma dan lapisan membran sel di sekitar permukaannya. Di bagian luar, dua pertiga anterior terdapat selubung tebal disebut akrosom yang terutama dibentuk dari alat Golgi. Selubung ini mengandung sejumlah enzim yang serupa dengan enzim yang ditemukan pada lisosom pada sel-sel tertentu, termasuk hialuronidase, yang dapat mencerna filamen proteoglikan dari jaringan, dan enzim proteolitik yang sangat kuat. Enzim-enzim tersebut mempunyai peranan penting dalam hal memungkinkan sperma untuk

membuahi ovum. Ekor spermatozoa, yang disebut flagellum, memiliki 3 komponen utama, yaitu: rangka pusat, membran sel, dan sekelompok mitokondria yang terdapat pada proximal (Aryoseto, 2009).

a

b c d

Gambar 2.4 Bentuk-bentuk sperma abnormal pada tikus. a. bentuk sperma normal; b.sperma abnormal dengan bentuk kepala seperti pisang; c. sperma abnormal dengan bentuk kepala tidak beraturan (amorphous); d. sperma abnormal dengan bentuk kepala terlalu membengkok (Washingthon et al., 1983).

Bentuk spermatozoa abnormal dapat diklasifikasikan berdasarkan bentuk kepala dan ekornya. Menurut Washington et al., (1983), bentuk sperma abnormal pada tikus terdiri dari bentuk kepala seperti pisang, bentuk kepala tidak beraturan (amorphous), bentuk kepala terlalu membengkok dan lipatan-lipatan ekor yang abnormal.

2.6.2 Viabilitas Spermatozoa mencit (Mus musculus L.)

Sampai saat ini parameter spermatozoa masih merupakan indikator terpenting pada evaluasi fertilitas pria. Salah satu indikator yang menentukan terjadinya fertilisasi atau terbentuknya embrio adalah viabilitas (daya hidup) spermatozoa, mengingat faktor tersebut erat kaitannya dengan fungsi spermatozoa itu. Dengan rendahnya viabilitas maka pembuahan tidak akan terjadi sebab spermatozoa mati sebelum membuahi sel telur (Rusmiati, 2007).

2.6.3 Motilitas Spermatozoa mencit (Mus musculus L.)

Gerakan Spermatozoa dikategorikan menurut WHO (1988) antara lain :

a. Jika sperma bergerak cepat dan lurus ke depan (gerak maju sangat baik)

b. jika geraknya lambat dan sulit maju lurus atau bergerak tidak lurus (gerakan lemah)

c. jika tidak bergerak maju dan d. jika sperma tidak bergerak

BAB 3

BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan digital Preset Counter akurasi 0,01g, split 1ml dan 3 ml, jarum gavage, bak bedah, dissecting set, kaca arloji, jarum pentul, pisau silet goal, botol winkler, gelas ukur 1000ml, tube 14ml, hemositometer, counter, blender, panci, freezer sanyo, hot plate cimarec 2, kamera digital, mikroskop, cover glass, objek glass, dan kertas label.

Bahan yang digunakan adalah mencit (Mus musculus L.) jantan, Testosteron Undekanoat (TU) 1000g/4ml ( Buatan Schering AG Jerman), Coeleum ricini, NaCl 0,9% , biji pepaya (Carica papaya L.), aquabidestilata 500 ml, Vitamin C 50g.

3.3 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang didesain mengikuti Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri dari 7 kelompok perlakuan yang masing-masing memiliki kontrol. Setiap kelompok terdiri dari 5 ulangan (n=5). Penelitian ini berlangsung selama 36 minggu dimana pada minggu ke-0 hingga minggu ke-24 diberikan pemberian ekstrak air biji papaya ( Carica papaya L.) setiap

harinya dan Testosteron Undekanoat (TU) setiap 6 minggu sekali. Pada minggu ke-24 hingga minggu ke-36 dilakukan pemulihan dengan memberikan asupan Vitamin C setiap harinya.

Tabel 3.1 Rancangan Penelitian (RAL) Minggu

Kelompok

0 6 12 18 24 30 36

Kontrol K0

(n=5)

K1 (n=5)

K2 (n=5)

K3 (n=5)

K4 (n=5)

K5 (n=5)

K6 (n=5)

Perlakuan P0

(n=5) P1 (n=5)

P2 (n=5)

P3 (n=5)

P4 (n=5)

P5 (n=5)

P6 (n=5)

3.4 Pelaksanaan Penelitian

3.4.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan

Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus L.) jantan yang sehat dan fertil serta berumur 8-11 minggu dengan berat 24-26 g sebanyak 70 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum (Mangkoewidjojo & Smith, 1988). Kandang mencit dijaga kebersihan dan kenyamanannya. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan.

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya

Prosedur ini dilakukan berdasarkan Ilyas (2001) Ekstrak air pepaya disiapkan dengan mengumpulkan buah pepaya yang berasal dari Kelurahan Kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan, Komplek Adam Malik, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya diambil dan dikeringkan dengan inkubator dengan suhu 50oC (± 3 hari) sampai kering. Biji yang telah kering dimasukkan ke dalam blender lalu dihaluskan hingga diperoleh bubuk halus biji pepaya. Ditimbang bubuk yang telah

halus sebanyak 30g kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah berisi air, selanjutnya dilakukan perebusan hingga mendidih dengan suhu 900C. Setelah mendidih hasil rebusan disaring dengan kertas saring hingga diperoleh hasil dan residu. Residu yang diperoleh direbus kembali, hingga diperoleh hasil dan residu lagi begitu seterusnya sampai residu tidak dapat dipergunakan kembali. Hasil rebusan dipanaskan hingga diperoleh reindaimen, reindaimen yang dihasilkan kemudian dilarutkan kembali dengan aquabidestilata 500ml, sesuai dengan kebutuhan penelitian. 3.4.3 Uji Skrinning Fitokimia Biji Pepaya

Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne (1987) yaitu:

a. Uji Flavanoid

Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk-an ke dalam erlenmeyer ydimasukk-ang berisi 100ml methdimasukk-anol. Kemudidimasukk-an dipdimasukk-anaskdimasukk-an hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl31%, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III

ditetesi H2SO4 dan tabung IV ditetesi NaOH 10% . Masing – masing tabung sebanyak

3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya. b. Uji Alkaloid

Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk-an ke dalam erlenmeyer ydimasukk-ang berisi 100ml metdimasukk-anol. Kemudidimasukk-an dipdimasukk-anaskdimasukk-an hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya.

Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk-an ke dalam erlenmeyer ydimasukk-ang berisi 100ml n- heksdimasukk-an. Kemudidimasukk-an dipdimasukk-anaskdimasukk-an hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky

(H2SO4(p)), tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak

3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya. d. Uji Terpenoid

Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk-an ke dalam erlenmeyer ydimasukk-ang berisi 100ml kloroform. Kemudidimasukk-an dipdimasukk-anaskdimasukk-an hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky

(H2SO4(p)) ,tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak

3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.

3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.)

Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Biji Pepaya (Carica papaya L.) diberikan dengan membandingkan dosis pada manusia. Perbandingan berat relawan (50 kg=50.000 g) dengan mencit adalah (25 g) adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 1/2000x500 mg TU = 0,25mg TU (Moeloek et al., 2004; Ilyas, 2007). Sedangkan ekstrak air biji pepaya 30 mg/0,5ml/hari/25 g berat badan mencit (Ilyas, 2001). Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan ekstrak air biji pepaya setiap hari. Kondisi penelitian terdiri dari tujuh (7) bagian perlakuan dan kontrol.

Dosis ekstrak air biji pepaya didasarkan pada dosis optimum penelitian Ilyas, dkk (2001) yakni 30 mg/0,5ml/hari/25 g BB mencit. Ulangan ditetapkan dengan rumus (t-1)(n-1) ≥ 15 (Federer, 1963), dimana t = perlakuan, dan n = ulangan sehingga didapatkan ulangan sebanyak 5 kali. Penggunaan dosis TU didasarkan pada

penelitian sebelumnya yang merekomendasikan pemakaiannya yakni 0,25 mg/25 g BB mencit/6 minggu (Moeloek et al., 2008; Ilyas, 2007).

Perlakuan penyuntikan TU dan pencekokan ekstrak air biji pepaya ditampilkan dalam bentuk skema pada Gambar 5 berikut.

Injeksi TU 2,5mg/ekor interval 6 minggu

Catatan : Pembedahan dilakukan setiap enam minggu sekali

Gambar 3.1 Jadwal Kegiatan Pemberian TU+Ekstrak Air Biji papaya selama 36 minggu

3.4.5 Pemberian Vitamin C

Buletin super nutrition (2002) menyatakan bahwa asupan asam askorbat (Vitamin C) yang dapat dikomsumsi oleh manusia berkisar antara 150-1500 mg. Pemberian Vitamin C ini dirancang jumlahnya dengan membandingkan dosis yang diberikan pada manusia. Setiap tablet Vitamin C mengandung 50 mg, Adapun cara pemberian dosisnya dimana 4 tablet Vitamin C (200mg) dikonversikan dengan berat badan antara mencit (Mus musculus) jantan dengan manusia yakni 25g/50.000g atau setara dengan 1/2000 x 4 tablet = 4/2000 = 1/500 x 50 = 0,1 mg/ mencit.

0 6 12 18 24 30 36

Pencekokan ekstrak biji papaya (30mg/ekor/mencit jantan setiap hari

Interval minggu Pencekokan Vitamin C

3.5 Parameter Pengamatan 3.5.1 Jumlah Sperma

Dilakukan pembedahan terhadap mencit ( Mus musculus L.) kemudian dipotong bagian cauda epididimis dan distal vas deferens. Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9 %, kemudian dilakukan pemotongan dengan pisau silet goal biasa, lalu suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes (50µL) lalu dimasukkan ke dalam kotak hemositometer Improved Neubauer, kemudian dilihat dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali.

Gambar 3.2 Kamar Hitung Improved Neubauer (Zaneveld et al., 1986) Pengamatan jumlah sperma dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad (1983), Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam rumus:

Jumlah sperma = N/2 x 105

Dimana, N = Jumlah sperma yang dihitung dalam kotak. spermatozoa/ml suspensi

Diambil sperma dari cauda epididimis dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, kemudian dikeringkan. Diberi pewarnaan giemsa selama 15 menit. Setelah itu diamati dengan mikroskop cahaya kemudian dihitung jumlah sperma, lalu ditentukan persentase jumlah sperma yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan cauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma yang abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan (amorphus), atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala (WHO, 1988).

Sperma normal

% Sperma Normal = x 100 % 100 spermatozoa (normal/abnormal)

3.5.3 Viabilitas sperma

Pemeriksaan viabilitas spermatozoa dilakukan pemberian warna giemsa pada hemositometer. Spermatozoa yang hidup tidak berwarna dan yang mati berwarna kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400x dan dihitung terhadap 100-200 spermatozoa. Sebagai hasilnya dinyatakan dalam bentuk persen hidup yang didapat dari hasil bagi jumlah spermatozoa hidup dengan jumlah total spermatozoa hidup dan mati yang dikalikan dengan 100% (WHO, 1988).

spermatozoa hidup

% Sperma Hidup = x 100 % 100 spermatozoa (hidup/mati) 3.5.4 Motilitas sperma

Suspensi sperma yang diperoleh terlebih dahulu dibiarkan selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya suspensi ini diteteskan pada kamar hitung Improved Neubauer, diamati dibawah mikroskop dengan melihat dan menghitung jumlah spermatozoa yang bergerak cepat, tidak bergerak, dan bergerak lamban (WHO, 1988).

3.6 Analisis Data

Data yang didapat dari setiap parameter (variabel) pengamatan dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif (variabel dependen) yang didapatkan, diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan (variabel independen) dengan bantuan program statistik komputer yakni program SPSS release 13. Urutan uji diawali dengan uji normalitas, uji homogenitas, Untuk keputusan uji statistik diambil pada taraf nyata 5% (p = 0,05) untuk melihat perbedaan dua perlakuan dilakuan dengan uji t (paramatrik) atau Mann-Whitney (non-paramatrik).

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Jumlah spermatozoa

Berdasarkan pengamatan jumlah spermatozoa mencit diperoleh data yang dapat dilihat pada (Lampiran 1 halaman 36). Data tersebut diuji normalitas dan homogenitas variansnya. Hasil uji menunjukkan bahwa data berdistribusi tidak normal (p<0,05). Data tersebut selanjutnya ditransformasi dengan X=y2 (square), hasil uji statistik juga menunjukkan distribusi yang tidak normal untuk itu dilakukan uji nonparametrik Mann Whiteney dan Wilcoxon. Hubungan jumlah spermatozoa mencit pada kelompok kontrol dapat dilihat pada Gambar 4.1 dibawah ini:

Gambar 4.1 Jumlah spermatozoa mencit kelompok kontrol di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% ( tn=p>0.05; *= p<0,05 )

0

50

100

150

K0 K1 K2 K3 K4 K5 K6

Ju

m

lah

S

p

e

r

m

at

oz

oa

(jt/mL

)

Lama Perlakuan (Minggu)

Kontrol

abc

a

bd cd

def

af abf

Hasil uji statistik menunjukkan adanya perbedaan jumlah spermatozoa antar kelompok kontrol, dimana kelompok kontrol pada minggu ke-24 (K4) memiliki jumlah yang tertinggi yang berbeda nyata dengan kelompok kontrol (K6), tetapi tidak berbeda terhadap (K5). Hubungan jumlah spermatozoa mencit pada kelompok perlakuan dengan waktu pemberian ekstrak air biji papaya dan TU, yang kemudian dilakukan pemulihan dengan vitamin C dapat dilihat pada Gambar 4.2 dibawah ini:

Gambar 4.2 Jumlah spermatozoa mencit kelompok perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05;*= p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Berdasarkan gambar diatas jumlah spermatozoa tertinggi antar kelompok perlakuan ditunjukkan pada minggu terakhir pemulihan yakni (P6) yang berbeda dengan kelompok (P4) dan (P5). Hubungan jumlah spermatozoa mencit dengan waktu pemberian ekstrak air biji pepaya dan TU, yang kemudian dilanjutkan dengan pemberian Vitamin C sebagai pemulihan antar kelompok kontrol dan perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.3.

Hasil uji statistik menunjukkan jumlah spermatozoa mencit kontrol minggu ke-24 (K4) berbeda nyata dengan jumlah spermatozoa mencit perlakuan (P4), jumlah spermatozoa mencit kontrol minggu ke-30 (K5) berbeda nyata dengan jumlah spermatozoa mencit perlakuan (P5), serta jumlah spermatozoa mencit kontrol minggu ke-36 berbeda nyata dengan spermatozoa mencit perlakuan (P6).

0 50 100 150 200

P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6

Ju

m

lah

S

p

e

r

m

at

oz

oa

(jt/mL

)

Lama Perlakuan (Minggu) Perlakuan

a b

c a

d

d c

Gambar 4.3 Jumlah spermatozoa mencit antar kelompok kontrol dan perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05; *= p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Peningkatan jumlah spermatozoa sangat dipengaruhi oleh pemberian Vitamin C secara oral terhadap mencit. Fauzi (2008), menyatakan bahwa Vitamin C dapat meningkatkan jumlah spermatozoa in vivo pada laki-laki infertil dengan dosis oral sekitar 200-1000mg/hari. Sememtara itu jumlah spermatozoa yang paling sedikit ditemukan pada P4 yang berbeda tidak nyata dengan P5. Pada perlakuan minggu ke-24 dan 30 terlihat bahwa jumlah spermatozoa relatif sedikit salah satu penyebab utama tergangunya keadaan seluler spermatozoa yang memicu terjadinya stress oksidatif.

Stress oksidatif adalah suatu kondisi dimana terjadi peningkatan kerusakan seluler yang disebabkan oleh oksigen dan oxygen-derived oxidants yang lebih dikenal sebagai ROS (Reactive Oxygen Spesies). Proses ini adalah hasil dari ketidakseimbangan antara produksi dan eliminasi ROS, dimana terjadi peningkatan pembentukan ROS tanpa diimbangi oleh eliminasinya oleh antioksidan dalam tubuh. Pembentukan ROS adalah proses fisiologi tubuh, namun apabila terjadi peningkatan yang berlebihan maka akan dapat berpengaruh negatif terhadap tubuh. Dalam hal ini

0

50

100

150

200

K0P0 K1P1 K2P2 K3P3 K4P4 K5P5 K6P6

Ju mlah S p e r mat oz oa (jt/mL )

Lama Perlakuan (Minggu)

Kontrol

abc

b

a

bd cd

c def d af d abf c tn

tn

*

*

*

*

0 6 12 18 24 30 36 a

dikaitkan dengan infertilitas pria. 40.88% pasien pria infertil memiliki sperma dengan kadar ROS yang tinggi. Selain merusak membran plasma, stress oksidatif juga dapat merusak integritas DNA pada nukleus spermatozoa. Kerusakan DNA ini pada akhirnya akan menginduksi terjadinya apoptosis sel yang pada akhirnya menyebabkan turunnya jumlah spermatozoa (Ozdamara, AS et al., 2004 dalam Sari 2006).

4.2 Motilitas Sperma

Berdasarkan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit jantan diperoleh data yang dapat dilihat pada (Lampiran 2 halaman 42). Data tersebut diuji normalitas dan homogenitas variansnya. Hasil uji menunjukkan bahwa berdistribusi tidak normal (p<0,05). Data tersebut selanjutnya ditransformasi dengan X=y2

(square), hasil uji statistik juga menunjukkan distribusi yang tidak normal untuk itu dilakukan uji nonparametrik Mann Whiteney dan Wilcoxon.

Pada kelompok perlakuan hubungan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit pada kelompok perlakuan dengan waktu pemberian ekstrak air biji papaya dan TU, yang kemudian dilakukan pemulihan dengan vitamin C dapat dilihat pada Gambar 4.4 dibawah ini:

Gambar 4.4 Konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% ( tn=p>0.05;*= p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

0 20 40 60 80 100

P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6

M

ot

ilitas

S

p

e

r

mat

oz

oa

(%)

Lama Perlakuan (Minggu) Perlakuan

a _a

b a

b

ab b

Berdasarkan Gambar 4.4 diatas, terlihat bahwa adanya pengaruh pemberian Vitamin C terhadap pemulihan spermatozoa, hal ini dapat kita lihat pada minggu ke- 24, 30 dan 36 . Peningkatan tertinggi konsentrasi motilitas yang mengalami pemulihan spermatozoa ditun.jukkan pada minggu ke-30 (P5) yang tidak berbeda nyata dengan (P4) dan (P6). Hubungan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit dengan waktu pemberian ekstrak air biji pepaya dan TU, yang kemudian dilanjutkan dengan pemberian Vitamin C sebagai pemulihan antar kelompok kontrol dan perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.5 dibawah ini:

Gambar 4.5 Konsentrasi motilitas spermatozoa mencit antar kelompok kontrol dan perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05;*=p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Hasil uji statistik menunjukkan konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol minggu ke-24 (K4) berbeda nyata terhadap konsentrasi motilitas spermatozoa mencit perlakuan (P4), konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol minggu ke-30 (K4) berbeda nyata terhadap konsentrasi motilitas spermatozoa mencit perlakuan (P5), sementara itu konsentrasi motilitas spermatozoa mencit kelompok kontrol minggu ke-36 (K6) tidak berbeda terhadap konsentrasi motilitas spermatozoa mencit perlakuan (P6).

0 20 40 60 80 100 120

K0P0 K1P1 K2P2 K3P3 K4P4 K5P5 K6P6

M

ot

ilitas

S

p

e

r

mat

oz

oa (

%

)

Lama Perlakuan (Minggu) Kontrol a a

ab b b

b tn

tn tn * * * tn

Adanya peningkatan konsentrasi motilitas spermatozoa menunjukkan bahwa pemulihan tingkat motilitas spermatozoa dipengaruhi oleh pemberian Vitamin C. Menurut Akmal et al., (2006) penelitian terhadap pasien infertil dengan keadaan oligosperma, motilitas sperma rendah dan jumlah sperma bentuk normal yang rendah, setelah diberikan suplemen vitamin C 1000 mg/hari selama 2 bulan, memperlihatkan peningkatan jumlah sperma, motilitas sperma dan jumlah sperma yang morfologinya normal. Penurunan konsentrasi spermatozoa pada minggu ke-36 disebabkan oleh keberadaan senyawa fitokimia yang terkandung di dalam biji pepaya seperti alkaloid dan terpenoid yang masi aktif di dalam spermatozoa yang memicu timbulnya radikal bebas.

Sperma mamalia kaya akan asam lemak tidak jenuh ganda oleh karena itu sangat rentan terhadap serangan ROS. Kemampuan ROS dalam menurunkan motilitas sperma melalui peroksidasi lipid membran sel sperma yang diinduksi oleh ROS menyebabkan penurunan fleksibilitas dan pergerakan ekor sperma, selain itu keberadaan ROS juga memicu kerusakan langsung mitokondria sperma yang menyebabkan penurunan ketersediaan energi yang meyebabkan penurunan motilitas sperma (Tremallen, 2008).

4.3 Viabilitas spermatozoa

Berdasarkan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit jantan diperoleh data yang dapat dilihat pada (Lampiran 3 halaman 48). Data tersebut diuji normalitas dan homogenitas variansnya. Hasil uji menunjukkan bahwa data berdistribusi normal (p>0,05). Selanjutnya dilakukan uji t (T- test). Hubungan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit dengan waktu pemberian ekstrak air biji pepaya dan TU, yang kemudian dilanjutkan dengan pemberian Vitamin C sebagai pemulihan antar kelompok kontrol dan perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.6 dibawah ini:

Gambar 4.6 Konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit antar kelompok kontrol dan perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05;*= p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Hasil uji statistik menunjukkan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kontrol minggu ke-24 (K4) berbeda nyata dengan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit perlakuan (P4), konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kontrol minggu ke-30 (K5) tidak berbeda nyata dengan konsentrasi viabilitas mencit perlakuan (P5), dan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kontrol minggu ke-36 berbeda nyata dengan konsentrasi spermatozoa mencit perlakuan (P6). Adanya perbedaan konsentrasi viabilitas spermatozoa mencit kontrol minggu ke-24 (K4) berbeda nyata dengan konsentrasi viabilitas mencit perlakuan (P4) dimana pada P6 terlihat peningkatan viabilitas atau daya hidup spermatozoa yang cukup tinggi setelah mendapatkan pemulihan dengan pemberian Vitamin C.

Dawson et al., (1987) dalam percobaannya yang menggunakan kontrol placebo pada pria menunjukkan bahwa Vitamin C meningkatkan viabilitas sperma dan menurunkan aglutinasi sperma. Penurunan daya hidup spermatozoa yang ditunjukkan pada P4 dan P5 sebagian besar dipengaruhi oleh keberadaan radikal bebas. Menurut Goodman, (2000) bahwa radikal bebas tidak selalu berasal dari luar tetapi juga dibuat dalam proses alami tubuh untuk hidup dan metabolisme akibat produksi radikal bebas yang cukup berlebih mengakibatkan terjadinya penurunan viabilitas atau daya hidup spermatozoa. Secara fungsional epididimis sangat tergantung pada hormon testosteron

0 20 40 60 80 100 120

K0P0 K1P1 K2P2 K3P3 K4P4 K5P5 K6 P6

V

iab

ilitas

S

p

e

r

mat

oz

oa

(%)

Lama Perlakuan (Minggu)

Kontrol Perlakuan tn

tn

*

* *

* *

Daya hidup spermatozoa juga sangat dipengaruhi oleh keberadaan hormon testosteron sebagaimana diketahui, testosteron diperlukan untuk daya hidup spermatozoa dalam epididimis (Arsyad, 1986 dalam Rusmiati 2007).

4.4 Morfologi spermatozoa

Berdasarkan konsentrasi morfologi spermatozoa mencit jantan diperoleh data yang dapat dilihat pada (Lampiran 4 halaman 52). Data tersebut diuji normalitas dan homogenitas variansnya. Hasil uji menunjukkan bahwa data berdistribusi tidak normal (p<0,05). Data tersebut selanjutnya ditransformasi dengan X=y2 (square), hasil uji statistik juga menunjukkan distribusi yang tidak normal untuk itu dilakukan uji nonparametrik Mann Whiteney dan Wilcoxon. Hubungan konsentrasi morfologi spermatozoa mencit pada kelompok perlakuan dengan waktu pemberian ekstrak air biji papaya dan TU, yang kemudian dilakukan pemulihan dengan vitamin C dapat dilihat pada Gambar 4.7 dibawah ini:

Gambar 4.7 Konsentrasi morfologi spermatozoa mencit kelompok perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05; *= p<0,05 ); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Hasil uji statistik menunjukkan adanya perbedaan antar kelompok perlakuan dimana persentase konsentrasi morfologi normal spermatozoa tertinggi pada minggu

0 20 40 60 80 100

P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6

M or fol ogi n or m al S p e r m at oz

oa (

%

)

Lama Perlakuan (Minggu)

Perlakuan b b c bc a c bc

pemulihan terlihat pada minggu ke-24 (P4) yang tidak berbeda nyata dengan minggu ke-30 (P5) dan minggu ke-36 (P6). Hubungan konsentrasi morfologi spermatozoa mencit dengan waktu pemberian ekstrak air biji pepaya dan TU, yang kemudian dilanjutkan dengan pemberian Vitamin C sebagai pemulihan antar kelompok kontrol dan perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.8 dibawah ini:

Gambar 4.8 Konsentrasi morfologi spermatozoa mencit antar kelompok kontrol dan perlakuan di setiap minggu Pengamatan. Huruf yang sama adalah tidak berbeda nyata pada taraf 5% (tn=p>0.05; *= p<0,05); grafik dalam kotak adalah minggu pemulihan

Hasil uji statistik juga memperlihatkan konsentrasi morfologi normal spermatozoa mencit kontrol minggu ke-24 (K4) berbeda nyata terhadap konsentrasi morfologi normal mencit perlakuan (P4), konsentrasi morfologi normal spermatozoa mencit kontrol minggu ke-30 (K5) berbeda nyata terhadap konsentrasi morfologi normal mencit perlakuan (P5), serta konsentrasi morfologi normal spermatozoa mencit kontrol minggu ke-36 (K6) berbeda nyata terhadap konsentrasi morfologi normal mencit perlakuan (P6).

Pemberian Vitamin C menunjukan adanya peningkatan morfologi normal spermatozoa mencit. Hal ini dapat kita lihat pada P4 yang tidak berbeda nyata dengan P5 yang mengalami penurunan. Penurunan ini disebabkan oleh radikal bebas yang diperoleh dari luar dan dalam tubuh tidak sampai mempengaruhi abnormalitas

0 20 40 60 80 100 120

K0P0 K1P1 K2P2 K3P3 K4P4 K5P5 K6P6

M or fol ogi n or m al S p e r m at oz

oa (

%

)

Lama Perlakuan (Minggu)

Kontrol Perlakuan a

c b

b bc

c bc *

*

* * * * *

0 6 12 18 24 30 36

morfologi spermatozoa. Keabnormalitasan spermatozoa tidak saja disebabkan oleh radikal bebas yang banyak, tetapi juga disebabkan oleh kurangnya kandungan hormon Folicle Stimulating Hormone (FSH) atau Luteinizing Hormone (LH) didalam Testis.

Kurangnya kandungan hormon tersebut juga dipengaruhi oleh keberadaan estrogen. Estrogen menyebabkan inhibisi baik pada sekresi FSH maupun LH, kondisi tersebut juga menghambat sekresi LH melalui umpan balik negatif terhadap hipotalamus-hipofisis. Hal ini dapat menekan pembentukan testosteron secara langsung pada sel Leydig, sehingga terjadi gangguan keseimbangan hormonal (Granner, 1985 dalam Rusmiati 2007). Yavetz et al., (2001) menyatakan bahwa, serum gonadotropin yakni FSH dan LH berkolerasi nyata dengan laju morfologi normal sperma.

Keabnormalitasan spermatozoa tersebut juga dipengaruhi oleh zat-zat aktif yang bersifat toksik yang berasal dari pemberian ekstrak air biji pepaya. Zat-zat aktif yang terkandung dalam fraksi heksan ekstrak biji papaya steriod dan triterpenoid maupun yang terkandung dalam fraksi metanol ekstrak biji pepaya muda (alkaloid), zat-zat tersebut diduga bersifat antifertilitas. Zat-zat aktif yang terkandung dalam biji pepaya tersebut dapat berefek sitotoksik, anti androgen atau berefek estrogenik. Efek sitotoksik ini akan menyebabkan metabolisme sel germinal terganggu (Lohiya, 2002 dalam Satriyasa &Pangkahila, 2010).

Penurunan spermatozoa normal tersebut juga dipengaruhi oleh keadaan membran plasma yang terganggu yang menyebabkan meningkatnya permeabilitas membran sel pada kepala spermatozoa sehingga banyak senyawa-senyawa yang tidak diinginkan dapat dengan mudah masuk ke dalam sel. Hal ini mengakibatkan terjadinya perubahan berupa pembengkakan dan perusakan bagian kepala spermatozoa sehingga menyebabkan kerusakan membran akrosom yang terletak di bagian anterior kepala spermatozoa. Membran akrosom yang telah hancur menyebabkan enzim-enzim hidrolitik yang terkandung di dalam akrosom keluar sehingga tudung akrosom yang dimiliki spermatozoa tersebut menjadi tidak utuh (Rizal, 2005 dalam Widya at al., 2010).

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya diperoleh hasil sebagai berikut:

a. Pemberian Vitamin C cenderung memulihkan jumlah spermatozoa mencit jantan (p<0,05) setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

b. Pemberian Vitamin C cenderung memulihkan motilitas spermatozoa mencit jantan (p<0,05) setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

c. Pemberian Vitamin C memulihkan viabilitas spermatozoa mencit jantan (p>0,05) setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

d. Pemberian Vitamin C cenderung memulihkan morfologi spermatozoa mencit jantan (p<0,05) setelah pemberian Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya Medan (Carica papaya L.)

5.2 Saran

a. Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut dengan dosis Vitamin C yang lebih tinggi

b. Sebaiknya dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan sumber antioksidan yang lain

DAFTAR PUSTAKA

Amir, A. 1992. Pengaruh penyuntikan ekstrak biji pepaya gandul (Carica papaya L.) terhadap sel-sel spermatogenik mencit dan jumlah anak hasil perkawinannya. Tesis Magister Sains. Jakarta: Biologi Kedokteran Universitas Indonesia. hlm. 14-15.

Agarwal, A., Prabakaran,S. And Said, T. 2005. Preventation of Oxidative Stress Injury to Sperm. J Androl, 26: 654-60.

Akmal, M. Qadri, J.Q., Al-Waili, N. S., Haq, A.& Saloom, K. Y. 2006. Improvement in human semen quality after oral supplementation of Vitamin C. J. Med Food, 9: 440-2.

Aryoseto, L. 2009. Hubungan antara jumlah leukosit dengan morfologi spermatozoa pada pasien di rumah sakit dokter kariadi. Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. hlm. 14.

Bremer, J.1959. Asexualisation a follow up study of 244 cases. New York: Macmillan. Buletin Super Nutrition Fact vs Fixion. 2002. No. 5. hlm. 1-8.

Dawson, E. B., Harris, W. A., Rankin, W.E., Charpentier, L. A., Mc Ganity, W. J. 1987. Effect of Ascorbic Acid on Male Fertility in Third Conference on Vitamin C. Annals of the New York Academy of Sciences. Vol.498.

Fauzi. T.M. (2008). Pengaruh pemberian timbale asetat dan vitamin c terhadap peroksidai lipid dan kualitas spermatozoa di dalam sekresi epididimis mencit jantan (Mus musculus L.) strain BALB/C. Tesis. Medan: Studi Biomedik Universitas Sumatera Utara. hal. 32.

Federer,W. (1963). Experimental Design, Theory and Aplication. New York:Mac Millan.

Goodman & Gillman. 1980. The Pharmaceutical Basis of Therapeutics. Edisi keenam. New York: Macmillan Publishing CO. Inc.

Goodman, S. 2000. Ester-C Vitamin C Generasi III. Jakarta. Penerbit PT Gramedia Pustaka Utama.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB.

Hart, H. 1987. Kimia Organik. Edisi keenam. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Ilyas, S. 2001. Efektifitas biji papaya (Carica papaya L.) terhadap jumlah spermatog nia-A, berat testis, berat badan tikus (Rattus sp.) dan jumlah anak hasil

perkawinannya. Media Farmasi An Indonesian Pharmaceutical Journal. 9 (2): 208-209.

Ilyas,S. 2007. Analysis of protein fas expression and caspase 3 activated at the suppression phase to sperm quantity by androgen/progestin combination. Jurnal Biologi Sumatera. 2(2): 45.

Ilyas, S. 2008. Efektivitas kontrasepsi hormonal pria yang menggunakan kombinasi testosteron undekanoat dan norestisteron enantat. Jurnal Biologi Sumatera. 3 (1): 23-28.

Iswara, A. 2009. Pengaruh pemberian antioksidan vitamin C dan E terhadap kualitas spermatozoa tikus putih terpapar allethrin.Skripsi. Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang. hlm. 4.

Kalie, M. B. 1996. Bertanam Pepaya. Edisi Revisi. Jakarta: Penerbit Swadaya.

Mangkoewidjojo,S.& Smith, J.B. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia. Naidu, K. 2003. Vitamin C in human health and disease is still a mystery ?. Nutrition

Journal. hlm. 1-10.

Rugh, R. 1968. The Mouse its Reproduction and Development. Burgess Publishing Company.

Rusmiati, 2007. Pengaruh ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan L) terhadap viabilitas spermatozoa mencit jantan (Mus musculus L.). Biosentaceae. 4(2): 63-70.

Satriyasa, B. K. & Pangkahila, W. I. 2010. Fraksi heksan dan fraksi metanol ekstrak biji pepaya muda menghambat spermatogonia mencit (Mus musculus) jantan. Jurnal Veteriner. 11 (1): 36-40.

Siregar, J. H. 2009. Pengaruh pemberian vitamin c terhadap jumlah sel leydig dan jumlah sperma mencit dewasa (Mus musculus L. ) yang dipapari monosodium glutamate (MSG). Tesis. Program Studi Ilmu Biomedik Universitas Sumatera Utara: Medan. hlm. 13-14.

Soehadi, K. & Arsyad, K.(1983). Analisis Sperma. Surabaya: Airlangga Universitas Press.

Sukadana, I .M., Santi, S. R., Juliarti, N. R. 2008. Aktivitas antibakteri senyawa golon gan triterpenoid dari biji pepaya (Carica papaya L.). Jurnal Kimia. 2(1): 15-18.

Sukarnawan, M. N. 2008. Uji daya reduksi ekstrak daun dewandaru (Eugenia uniflora L.) terhadap ion ferri. Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Suparni, 2009. Pengaruh pemberian Vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa ( Mus musculus L.) yang dipaparkan monosodium glutamate (MSG). Tesis. Program Studi Ilmu Biomedik Universitas Sumatera Utara: Medan. hlm. 31.

Tadjudin, 1988. Pengumpulan dan Pemeriksaan Semen Manusia. Penuntun Laboratorium WHO Untuk Pemeriksaan Semen Manusia dan Interaksi Semen Getah Servik, FKUI, Jakarta. hlm. 7.

Tjitrosoepomo, G. 2004. Taksonomi Tumbuhani (Spermatophyta). Cetakan ke-8. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Tremallen, K. 2008. Oxidative Stress and Male Infertility – A Clinical Perspective. Human Reproduction Update.

Washington,W.J., R.C. Murthy A. Doye K. Eugene D. Brown and I. 1983. Induction of Morphologically Abnormal sperm in rats exposed to oxylene. Arch. Androl 11.

Widya, S. Kartini, E. Fitriani. 2010. The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (Mus musculus). Jurnal Natural. 10(2): 16

World Health Organization (WHO), 1988. Penuntun Laboratorium WHO untuk pemeriksaan Semen Manusia dan Interaksi semen-getah serviks, Terj. Oleh M.K. Tadjudin, Jakarta: Penerbit FK-UI. hlm. 14.

Yavetz, H., Leah Yogev, Sandra Kleiman, Amnon Botchan, Ron Hauser, Joseph, B. Lessing, Gedalia Paz, And Ronni Gamzu. 2001. Morphology of Testicular Sperma Obtained By Testiscular Sperm Extraction in Obstructive And Nonobstructive Azoospermic Men And Its Relation To Fertilization Success In The In Vitro Fertilization- Intraplasmic Sperm Injection System. Journal Of Andrology. 22(3).

LAMPIRAN 1. Data Rataan Jumlah Spermatozoa mencit (Mus musculus L.) Rataan jumlah spermatozoa mencit (Mus musculus L.) setelah pemberian kombinasi ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) dan testosteron undekanoat (TU) serta Pemulihan dengan Vitamin C ( jt/mL, X±SD)

Lama Pemberian (minggu) Kontrol (jt/ml) Perlakuan (jt/ml) 0 66.13±38.10 61.53±16.86 6 39.83±7.26 133.27±49.33 12 84.93±15.68 63.13±26.50 18 104.40±13.41 11.47±5.57 24 117.26±23.93 4.07±4.97

30 65,23±23,83 19.93±17.20

36 72.13±22.87 22.23±10.94

Hasil Uji Statistik Jumlah Spermatozoa Mencit

Mann-Whitney Test

Tests of Normality

.108 35 .200* .961 35 .245

.216 35 .000 .826 35 .000

kelompok kontrol perlakuan jlhsperma

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

This is a lower bound of the true s ignificance. *.

Lilliefors Significance Correction a.

Test of Homogeneity of Variance

1.317 1 68 .255

.014 1 68 .906

.014 1 43.599 .906

.248 1 68 .620

Based on Mean Based on Median Based on Median and with adjusted df

Based on trimmed mean jlhsperma

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

Ranks

35 44.93 1572.50

35 26.07 912.50

70 kelompok kontrol perlakuan Total jlhsperma

LAMPIRAN 7. Prosedur Pembuatan Ekstrak Air biji pepaya (Carica papaya L.)

dikeringkan dengan inkubator pada suhu 500

dimasukkan biji pepaya kering ke dalam blender dan dihaluskan C (±3hari)

i

direbus hinggah mendidih

Disaring dengan kertas saring dan dipisahkan residunya

Dilar Dilarutkan dengan aquabidestilata 500ml sesuai dengan

kebutuhan penelitian

Biji Pepaya

Hasil Bubuk pepaya

Hasil Rebusan

LAMPIRAN 8. Prosedur uji skrining fitokomia biji pepaya (Carica papaya L.) a. Uji flavonoid

dikeringkan dihaluskan

dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol dipanaskan hingga ¼ volume awal kemudian disaring

dimasukkan kedalam 4 tabung reaksi

tabung I ditetesi FeCl3, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H2SO4

diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya

(p), tabung IV ditetesi NaOH 10%, masing-masing sebanyak 3-5 tetes

b. Uji Alkaloid

dikeringkan dihaluskan

dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol dipanaskan hingga ¼ volume awal kemudian disaring

dimasukkan kedalam 4 tabung reaksi

tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi wagner , tabung III ditetesi Bouchard, tabung IV ditetesi Dragendorf, masing-masing sebanyak 3-5 tetes

diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya 3 g biji pepaya

(Carica papaya L.)

Hasil

3 g biji pepaya (Carica papaya L.)

c. Uji Steroid

dikeringkan dihaluskan

dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol dipanaskan hingga ¼ volume awal kemudian disaring

dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi

tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky H2SO4(p), tabung III ditetesi Libermen-Bouchard, masing-masing sebanyak 3-5 tetes diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya

d. Uji Terpenoid

dikeringkan dihaluskan

dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol dipanaskan hingga ¼ volume awal kemudian disaring

dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi

tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky

H2SO4(p), tabung III ditetesi Libermen-Bouchard, masing-masing sebanyak 3-5 tetes diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya 3 g biji pepaya

(Carica papaya L.)

Hasil

3 g biji pepaya (Carica papaya L.)

LAMPIRAN 9. Prosedur Pengamatan Spermatozoa Mencit a. Jumlah Spermatozoa

dilakukan pembedahan

dipotong bagian epididimis dan bagian distal vas deferens

dimasukkan cauda epididimis ke dalam cawan arloji yang berisi NaCl 0,9 %

dipotong dengan pisau silet diambil dengan pipet tetes

dimasukkan ke dalam kaca hemositometer improved neubauer

diamati dibawah mikroskop dilakukan penghitungan

b. Motilitas Spermatozoa Mencit

dilakukan pembedahan

dipotong bagian epididimis dan bagian distal vas deferens

dimasukkan cauda epididimis ke dalam cawan arloji yang berisi NaCl 0,9 %

dipotong dengan pisau silet diambil dengan pipet tetes

dimasukkan ke dalam kaca hemositometer improved neubauer

diamati dibawah mikroskop

dilakukan penghitungan sperma yang bergerak dan tidak bergerak

Mus musculus L.

Hasil

Mus musculus L.

c. Viabilitas Spermatozoa Mencit

dilakukan pembedahan

dipotong bagian epididimis dan bagian distal vas deferens

dimasukkan cauda epididimis ke dalam cawan arloji yang berisi NaCl 0,9 %

dipotong dengan pisau silet diambil dengan pipet tetes

dimasukkan ke dalam kaca hemositometer improved neubauer

diamati dibawah mikroskop

dilakukan penghitungan sperma yang hidup dan yang mati

d.Morfologi Spermatozoa Mencit

dilakukan pembedahan

dipotong bagian epididimis dan bagian distal vas deferens

dimasukkan cauda epididimis ke dalam cawan arloji yang berisi NaCl 0,9 %

dipotong dengan pisau silet diambil dengan pipet tetes

dimasukkan ke dalam kaca hemositometer improved neubauer

diamati dibawah mikroskop

dilakukan penghitungan sperma yang normal dan abnormal

Mus musculus L.

Hasil

Mus musculus L.

LAMPIRAN 10. Prosedur Penyedian Vitamin C

digerus

dilakukan pengenceran Tablet Vitamin C