Jenis Dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Skema Alur Penelitian

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan sederhana acak lengkap pola searah.

B. Variabel Dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis pemberian infusa biji Persea americana Mill. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung penelitian ini adalah perubahan histopatologi organ testis dan uterus tikus galur Sprague Dawley setelah pemberian subakut infusa biji Persea americana Mill.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini antara lain, kondisi hewan uji, yaitu tikus jantan galur Sprague Dawley berjenis kelamin jantan dan betina dengan berat badan 150-250 g dan umur 2-3 bulan diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Variabel pengacau lainnya, yaitu bahan uji yang digunakan berupa biji alpukat yang mempunyai waktu panen, waktu tumbuh dan panen yang sama. Frekuensi pemberian infusa Persea americana satu kali sehari dua puluh delapan hari 32 berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama secara per oral bahan uji yang digunakan berupa biji Persea americana yang diperoleh dari Depot Es Teller 77, Galeria Mall, Yogyakarta yang diambil pada bulan Juni 2014.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam

penelitian ini adalah kondisi patologis tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley, spermatogenesis tikus jantan dan siklus estrus tikus betina.

2. Definisi operasional

a. Infusa Persea americana Mill. Infusa P. americana diperoleh dengan menimbang 8 g serbuk kering biji P. americana dibasahi dalam 16 ml aquadest kemudian ditambahkan aquadest sampai volume 100 ml dan dipanaskan pada suhu 90 C selama 15 menit sehingga diperoleh infusa biji Persea americana Mill. dengan konsentrasi 8 bv . b. Biji Persea americana Mill. Biji Persea americana Mill. yang digunakan adalah biji alpukat segar yang tidak busuk. c. Variasi dosis infusa biji P. americana Mill. Dosis yang diberikan kepada tikus yaitu: dosis I= 202,24 mgkgBB, dosis II= 360 mgkgBB, dosis III= 640,8 mgkgBB dan dosis IV= 1140,6 mgkgBB. d. Perubahan histopatologis. Perubahan morfologi organ testis dan uterus ditunjukkan dengan adanya perbedaan pada organ tersebut antara perlakuan dan kontrol berdasarkan gambaran histopatologis organ setelah pemberian infusa biji alpukat. e. Sifat efek toksik. Sifat efek toksik yang mungkin muncul adalah terbalikkan atau tak terbalikkan. f. Pemberian subakut. Pemberian infusa biji Persea americana Mill. satu kali sehari selama 28 hari berturut-turut pada waktu yang sama secara per oral.

C. Bahan Penelitian

Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : a. Hewan uji yang digunakan yaitu tikus jantan galur Sprague Dawley dengan umur 2-3 bulan dan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. b. Biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Depot Es Teller 77, Galeria Mall, Yogyakarta yang diambil dari perkebunan alpukat di Klaten pada bulan Juni 2014. c. Pelarut untuk infusa yang digunakan adalah aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. d. Bahan kontrol negatif adalah aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. e. Bahan untuk makanan hewan uji yaitu pellet AD2 dan bahan minuman untuk hewan uji yaitu air reverse osmose RO yang diperoleh dari Laboratorium Imono, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. f. Bahan untuk pemeriksaan histologis adalah formalin 10 yang dibuat dengan mengencerkan formalin 30 dengan aquadest sesuai volume yang dikehendaki. Formalin 30 diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis, Fakultas Farmasi, Sanata Dharma, Yogyakarta.

D. Alat Atau Instrumen Penelitian 1. Alat pembuatan serbuk

Timbangan digital, oven, blender, ayakan no.40, wadah untuk menyimpan serbuk biji alpukat.

2. Alat penetapan kadar air

Alat moisture balanced dan sendok.

3. Alat pembuatan infusa biji Persea americana Mill.

Panci enamel, termometer, stopwatch, bekker glass, gelas ukur, cawan porselen, batang pengaduk, corong, labu alas bulat, penangas air, timbangan analitik, kain flanel. 4. Alat perlakuan dan pemeriksaan histopatologis Kandang metabolik tikus metabolic cage, jarum suntik per oral, spuit injeksi, timbangan, seperangkat alat bedah, alat-alat gelas dan pot-pot untuk menyimpan organ.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi biji Persea americana Mill.

Determinasi tanaman Persea americana Mill. dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Penjual dari Depot Es Teller 77, Galeria Mall, Yogyakarta yang diambil dari perkebunan alpukat di Klaten pada bulan Juni 2014.

3. Pembuatan serbuk

Biji Persea americana Mill. dibersihkan dari kulit luarnya, dicuci dengan air mengalir kemudian dipotong tipis, lalu dikeringanginkan kedalam oven yang sudah diatur suhunya, 50°C selam 72 jam. Potongan biji yang sudah kering kemudian diserbuk dan diayak dengan ayakan no. 40.

4. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Sampel serbuk biji Persea americana Mill sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam alat moisture balanced pada suhu 105 C selama 15 menit, kemudian secara otomatis persen kadar air akan muncul pada alat moisture balanced.

5. Pembuatan infusa biji Persea americana Mill.

Serbuk kering biji Persea americana Mill. ditimbang 8,0 g dan dimasukkan dalam panci enamel lalu dibasahi dengan aquadest sebanyak dua kali bobot bahan yang ditimbang, yaitu 16 ml aquadest. Sebanyak 100 ml pelarut aquadest dimasukkan kedalam panci enamel kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 15 menit. Campuran kemudian diambil dan ditambah aquadest panas sehingga didapatkan volume perasan 100 ml.

6. Penetapan dosis infusa biji Persea americana Mill.

Peringkat dosis infusa biji alpukat didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan oleh masyarakat yaitu ± 2 sendok makan 4 g serbuk yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g70kgBB manusia. Berdasarkan data diatas maka konversi dosis manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018 Dosis untuk tikus 200 g = 0,018 x 4 g = 72 mg0,2 kgBB = 360 mgkgBB Berdasarkan hasil orientasi infusa penelitian yang dilakukan oleh Yoseph 2013, konsentrasi maksimal infusa biji alpukat yang dapat dibuat adalah 8g100ml dengan asumsi berat badan hewan uji maksimal adalah 350 g dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o = 5 ml. Maka dilakukan perhitungan untuk menetukan dosis tinggi perlakuan dengan rumus : D x BB = C X V D x 350 g = 8 g 100ml x 5 ml D = 1142,8 mgkgBB Kemudian dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi. Untuk menentukan peringkat dosis infusa biji Persea americana Mill. dilakukan perhitungan sebagai berikut: = Faktor Kelipatan Berdasarkan faktor kelipatan yang maka diperoleh 4 peringkat dosis, yaitu: Dosis I : 360 mgkgBB : 1,78 = 202,24 mgkgBB Dosis II : 360 mgkgBB Dosis III : 360 mgkgBB x 1,78 = 640,8mgkgBB Dosis IV : 640,8 mgkgBB x 1,78 = 1140,6 mgkgBB

7. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif

Untuk menetukan dosis aquadest digunakan berat badan tertinggi untuk mengetahui jumlah dosis maksimum yang dapat diberikan kepada hewan uji. Berdasarkan rumus didapatkan dosis maksimum yaitu: D x BB = C x V D x 350 g = 1 g100 ml x 5 ml D = D = D = 14285 mgkgBB Maka dosis aquadest adalah 14285 mgkgBB

8. Penyiapan hewan uji

Hewan uji yang digunakan terdiri dari tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 g, berjumlah 50 ekor 25 jantan dan 25 betina disiapkan dan ditempatkan dalam metabolic cage di mana dalam satu kandang untuk satu tikus. Tiga hari sebelum perlakuan diadaptasikan terlebih dahulu di metabolic cage. Penelitian dengan hewan coba telah mendapat etical clearance dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada Lampiran 6.

9. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Penelitian ini membutuhkan 50 ekor tikus, yakni 25 ekor tikus jantan dan 25 ekor tikus betina yang masing-masing dibagi secara acak ke dalam lima kelompok dimana setiap kelompok akan berisi 5 tikus. Kelompok I adalah tikus yang diberikan infusa biji alpukat dengan dosis 202,24 mgkgBB, kelompok II diberikan dosis 360 mgkgBB, kelompok III diberikan 640,8 mgkgBB, kelompok IV diberikan dosis 1140,6 mgkgBB dan kelompok V adalah tikus yang diberikan aquades sebagai kontrol dengan dosis 14285 mgkgBB. Pemberian infusa biji Persea americana Mill. dilakukan satu kali sehari selama dua puluh delapan hari berturut-turut secara peroral. Pada hari ke-29, sebanyak tiga tikus dari tiap dosis dikorbankan, diambil organ testis dan uterus kemudian dilakukan pemeriksaan histopatologis, selanjutnya dilakukan uji reversibilitas selama 14 hari.

10. Prosedur pemusnahan hewan uji

Sebelum pembedahan, hewan uji dikorbankan dengan cara anastetika overdosis, yakni memasukkan tikus kedalam wadah tertutup berisi eter yang akan diinhalasi oleh tikus.

11. Prosedur pembedahan hewan uji

Pembedahan hewan uji atau yang di sebut juga proses nekropsi diawali dengan meletakkan hewan yang telah dieutanasi pada papan nekropsi dengan posisi rebah dorsal perut menghadap keatas dan posisi kepala menjauhi operator. Kemudian membasahi permukaan tubuh tikus dengan air, lalu dengan menggunakan foceps kulit abdomen diangkat dan dibuat irisan digunting sepanjang ventral midline dagu bawah atau irisan sub kutan dan diambil organ testis pada tikus jantan dan uterus pada tikus betina dengan menggunakan pinset. Setelah organ diambil kemudian organ dicuci dengan NaCl 0,9 dan dimasukkan kedalam pot formalin 10 untuk diawetkan. Hewan uji yang sudah diambil organnya, lalu dikubur di halaman laboratorium. Proses pembedahan ini dilakukan pada hari ke-29 terhadap tiga tikus dari setiap kelompok baik kelompok perlakuan dengan empat peringkat dosis maupun pada kelompok kontrol. Selain itu, juga dilakukan pada hari ke-15 terhadap dua tikus yang tersisa untuk uji reversibilitas.

12. Uji reversibilitas

Uji reversibilitas dilakukan selama 14 hari dimulai setelah perlakuan 28 hari yang dilakukan pada dua hewan uji yang tersisa baik pada kelompok perlakuan empat peringkat dosis maupun pada kelompok kontrol. Pada uji reversibilitas, pemberian infusa biji alpukat pada kelompok perlakuan serta aquadest pada kelompok kontrol pada hewan uji dihentikan, namun tetap diberikan asupan makan maupun minum. Setelah hari ke-15 maka dilakukan pembedahan pada seluruh tikus pada uji reversibilitas dan dilakukan pengamatan histopatologis.

13. Pembuatan preparat dan pemeriksaan histopatologis

Testis dan uterus yang telah disimpan dalam larutan formalin 10 dicelupkan ke dalam aquadest. Kemudian dibuat preparat dengan cara melakukan prosedur: trimming, dehidrasi, embedding, cutting, stainingpewarnaan teknik H- E dan mounting Carsun, 1990. Setelah menjadi preparat dilakukan pembacaan dan pengamtan slide dengan mikroskop untuk mendiagnosis gambaran histopatologis organ testis dan uterus. Prosedur ini dilakukan oleh pihak Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

14. Pengamatan data pendukung

a. Penimbangan berat badan hewan uji Dilakukan penimbangan berat badan hewan uji setiap hari untuk menentukan volume infusa biji alpukat yang diberikan setiap harinya namun data yang digunakan sebagai data pendukung adalah data penimbangan hewan uji tiap minggunya. Data penimbangan berat badan hewan uji dihitung purata perubahan berat badan tiap kelompok hewan uji pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data perubahan berat badan hewan uji antar minggu dan kelompok perlakuan dianalisis secara statistik dengan analisis General Linear Model metode Multivariate. b. Pengukuran asupan pakan dan minum hewan uji Hewan uji diberikan asupan pakan 30 g setiap harinya dan asupan minum 100 ml setiap harinya. Untuk mengetahui sebarapa besar asupan pakan yang dikonsumsi oleh tikus maka dilakukan pengukuran setiap harinya. Cara mengukur besarnya asupan pakan yang diterima oleh tikus dengan menimbang pakan yang diberikan pada hari pertama, kemudian pada hari kedua dilakukan penimbangan kembali pakan yang masih tertinggal pada wadah. Selisih penimbangan berat pakan pada hari pertama dan kedua dihitung sebagai asupan pakan yang dikonsumsi pada hari pertama, begitu seterusnya untuk hari selanjutnya.

F. Tata Cara Analisis Hasil

1. Pemeriksaan histopatologis organ

Data pemeriksaan histopatologis organ dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan mikroskop cahaya Olympus dp 10 berdasarkan perubahan morfologi yang terjadi dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif.

2. Uji reversibilitas

Data uji reversibilitas dianalisis secara kualitatif berdasarkan perubahan morfologi yang terjadi pada kelompok tikus yang diberhentikan dari pemberian infusa biji alpukat dibandingkan dengan kelompok tanpa perlakuan.

3. Pengamatan berat badan hewan uji

Data penimbangan berat badan hewan uji dihitung purata perubahan berat badan tiap kelompok hewan uji pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Data perubahan berat badan hewan uji antar minggu dan kelompok perlakuan dianalisis secara statistika dengan analisis General Linear Model metode Multivariate hingga diperoleh nilai signifikansi sig. berat badan.

4. Pengukuran asupan pakan dan minum hewan uji

Data asupan pakan dan minum dianalisis dengan cara menghitung purata makanan dan minuman yang dihabiskan tiap kelompok hewan uji setiap harinya, kemudian dibuat grafik perubahan pola makan dan minum hewan uji.

G. Skema Alur Penelitian

Hewan uji ditempatkan dalam metabolic cage secara acak dan diadaptasikan selama 7 hari sebelum perlakuan Hewan uji ditimbang selama 28 hari dan diberi asupan makan minuim setiap hari Hewan uji diberi infusa biji alpukat hari 1-28 dengan waktu pemberian yang sama, pada kelompok: Kel. I Infusa biji alpukat 202,4 mgkgBB Kel. II Infusa biji alpukat 360 mgkgBB Kel. III Infusa biji alpukat 640,8 mgkgBB Kel. IV Infusa biji alpukat 1140,6 mgkgBB Kel.Kontrol Aquadest 14285 mgkgBB Dilakukan pengukuran asupan pakan, minum dan berat badan selama 28 hari setiap pagi Pada hari ke-29, 3 hewan uji tiap kelompok dibedah dan diamati histopatologis testis uterus Dua hewan uji sisanya dibiarkan hidup tanpa diberi perlakuan selama 14 hari uji reversibilitas 50 ekor tikus 25 jantan dan 25 betina masing-masing dibagi dalam 5 kelompok Pada hari ke-15 hewan uji yang tersisa pada saat uji reversibilitas dikorbankan dan dilakukan pembedahan serta pengamatan histopatologi organ testis dan uterus

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan ada tidaknya efek toksik dan sifat efek toksik infusa biji alpukat terhadap organ testis dan uterus tikus dilihat dari gambaran histopatologisnya. Selain itu, juga untuk mengevaluasi reversibilitas keterbalikan efek toksik yang terjadi. Tolok ukur yang digunakan adalah tolok ukur kualitatif berdasarkan analisis perubahan histopatologis yang dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif terhadap organ testis dan uterus tikus. Data pendukung penelitian ini adalah data berat badan, data asupan pakan dan data asupan minum. Data berat badan hewan uji antar minggu dan kelompok perlakuan dianalisa secara statistika dengan analisis General Linier Model dengan metode Multivariate. Data asupan pakan dan minum dianalisis dengan cara dibuat grafik untuk melihat apakah pemberian infusa biji alpukat dapat mempengaruhi pola makan dan minum hewan uji. Gambaran histopatologis organ diperoleh berdasarkan derajat kerusakan sel testis dan uterus pada masing-masing kelompok. Data uji reversibilitas dianalisis secara kualitatif berdasarkan perubahan struktural jaringan yang terjadi pada kelompok tikus yang diberhentikan dari pemberian infusa biji alpukat dibandingkan dengan kelompok tanpa perlakuan. 45