20
3.4.2. Variabel terikat Variabel terikat pada penelitian ini adalah menilai respon besar kontraksi
atau relaksasi otot polos kandung kemih guinea pig setelah pemberian bahan uji.
3.5 Alur penelitian
3.6 Cara kerja penelitian
3.6.1 Tahap persiapan 1.
Tahap persiapan bahan uji Penelitian ini menggunakan larutan ekstrak kafein sebagai bahan uji.
Peneliti melakukan pemesanan bahan uji dari katalog Sigma Aldrich.Kemudian melarutkan serbuk kafein dengan akuades untuk membuat stock solution. Kafein
dengan berat molekul sebesar 194,19 akan diambil sebanyak 0.0194 mg dan Persiapan alat dan
bahan untuk penelitian Persiapan dan
pengenceran ektrak kafein menjadi
berbagai konsentrasi
Membunuh hewan penelitian dengan
membenturkankepalan ya pada benda keras
dan segera menyembelihnya
Pembuatan strip otot polos kandung kemih
guinea pig
Melakukan penelitian ekstrak kafein dalam
oragan bath Merekam dan
mengolah data
21
ditambah kan dengan akuades sebanyak 1 ml sehingga mendapatkan larutan kafein dengan konsentrasi 100 mM.Selanjutnya stock solution kafein tersebut
akan diencerkan menjadi beberapa konsentrasi menggunakan akuades mulai dari 0,01 µM sampai 100 µM. Semua variasi sampel tersebut akan diujikan pada otot
polos kandung kemih guinea pig.
2. Tahap pembuatan cairan fisiologis
Cairan fisiologis yang dipakai dalam penelitian ini adalah larutan Krebs- Henseleit. Larutan Krebs-Henseleit merupakan campuran berbagai macam
senyawa dalam akuades sehingga mirip dengan cairan dalam tubuh. Larutan Krebs-Henseleit dapat mensuplai kebutuhan jaringan diluar tubuhnya. Oleh
karena itu, larutan Kresbs-Henseleit sangat diperlukan untuk mempertahankan hidup strip otot polos. Komposisi larutan Krebs-Henseleit adalah :
Tabel 1 Komposisi larutan krebs-henseleit
Bahan mmoll
NaCl
121.6
KCl 4.7
NaHCO
3
15.4
KH2PO
4
1.2
MgCl
2
1.2
Glucose 11.5
CaCl2 2.5
3. Tahap preparasi jaringan
Mempersiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan untuk penelitian. Mengkalibrasi organ bath, melarutkan karbakol dan menyiapkan karbogen yang
berisi 97 oksigen dan 3 karbondioksida. Penelitian ini menggunakan lima ekor guinea pig dengan dua ekor jantan
dan tiga ekor betina. Berat guinea pig sekitar 500-700 gram dan umur rerata enam bulan. Sebelum hewan uji dibunuh dan diambil kandung kemihnya, peneliti harus
menyiapkan cawan petri yang berisi larutan Krebs Henseleit dengan suhu
22
4
o
C.Selain itu peneliti sudah harus siap dengan semua alat yang diperlukan seperti handscon, gunting dan papan diseksi.
Hewan uji dibunuh dengan membenturkan kepala pada tempat yang keras dan segera menyembelihnya. Kandung kemih harus diambil secepat mungkin
melalui insisi secara longitudinal pada bagian tengah abdomen bawah. Kandung kemih langsung dimasukan ke dalam larutan Krebs Henseleit yang dingin
tersebut. Selanjutnya kandung kemih akan dibagi menjadi dua bagian, pemotongan
tersebut dilakukan dengan prinsip tidak memberikan regangan pada jaringan. Ambil bagian anterolateralnya kemudian pisahkan lapisan otot dari lapisan
mukosa dan serosa kandung kemih dengan menggunakan alat bedah minor dan dibantu dengan kaca pembesar. Kandung kemih dipotong dan dibentuk strip otot
polos sebanyak 3-5 strip dengan ukuran 0,5 cm x 1 cm. Ujung strip otot polos diikat dengan tali pada kedua sisinya.
Kandung kemih digantung secara vertikal dalam chamber organ bath. Ujung tali bagian atas dihubungkan ke transducer yang tersambung dengan
amplifier serta komputer, sedangkan ujung tali lainnya difiksasi pada bagian bawah chamber. Preparat menggantung dan tidak menempel pada dinding
chamber. Preparat direndam dalam larutan Krebs Hanseleit sebanyak 50cc dengan suhu 37
o
C dan dioksigenasi dengan karbogen 97 O
2
dan 3 CO
2
. Selanjutnya strip otot polos diberikan tegangan istirahat sebesar 0,5g dan ditunggu selama 60
menit. Transducer tersebut dihubungkan dengan komputer yang memiliki piranti lunak labchart dari ADInstrumen untuk menilai kontraktilitas strip otot polos.
24
Gambar 8 Prosedur penelitian karbakol
2. Tahap pengujian bahan ekstrak
Kemudian setelah ditunggu 60 menit lanjutkan penelitian dengan menilai bahan uji kafein. Sebelum kafein dimasukan, terlebih dahulu masukan karbakol
sebagai penginduksi awal kontraktilitas otot polos. Kontraksi otot polos yang meningkat oleh karbakol tersebut dianggap sebagai kontraksi maksimal otot
polos. Ketika memperlihatkan gambaran kontraksi yang sudah datar plateu ini merupakan saat yang tepat untuk memasukan bahan uji kafein. Bahan uji di
berikan bertahap mulai dari 0,01 µM sampai 100 µM dengan selang waktu lima menit. Melihat rekaman hasil kontraktilitas otot polos kandung kemih yang
dipengaruhi oleh pemberian bahan uji pada Labchart. Sebagai kontrol maka kita harus menguji juga bahan pelarut kafein yang di
gunakan untuk melarutkan kafein. Bahan pelarut kafein tersebut adalah akuades. Hal ini dilakukan untuk menilai apakah pelarut tersebut juga memiliki efek
kontraktilitas terhadap otot polos kandung kemih atau tidak. Prosedur yang sama seperti penilaian bahan uji diterapkan dalam pengujian bahan pelarut. Prosedur
penelitian dapat dilihat pada gambar 9.
