WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN RENCANA ANALISIS DATA

22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 hingga Mei 2014. Pembuatan ekstrak dilakukan di laboratorium Penelitian 2 dan di Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor, pemeliharaan dan perlakuan hewan uji di Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Sedangkan untuk pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Patologi Universitas Indonesia.

3.2. ALAT DAN BAHAN

3.2.1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender Phillips, timbangan analitik AND GH-202 dan Wiggen Hauser, vacuum rotary evaporator EYELA, Freeze Dryer EYELA FDU-1200, erlenmeyer, beakerglass, batang pengaduk, spatula, kertas saring, kapas, corong gelas, tabung reaksi, pipet tetes, tanur Thermo Scientific, alumunium foil, timbangan hewan Ohauss, kandang tikus beserta tempat makanan dan minum, sonde oral, wadah pembiusan, alat bedah minor, kaca objek dan penutupnya, cawan penguap, Mikropipet Eppendorf Research plus, mikroskop cahaya Motic dan Epson dan Hemositometer Improved Neubauer NESCO.

3.2.2. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba dari kemangi Ocimum americanumL. yaitu seluruh bagian tanaman beberapa sentimeter di atas permukaan tanah, kecuali akar, yang digunakan sebagai simplisia disebut herba.Herba kemangi diiperoleh pada tanggal 16 Februari 2014 dariDesa Grogol, Kecamatan Limo, Depok dan diambil pada saat usia tanaman 2 bulan. Sebelum dilakukan penelitian, herba kemangi terlebih dahulu dideterminasi “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi– LIPI Bogor untuk memastikan kebenaran simplisia. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 70, pereaksi untuk penapisan fitokimia amonia 25 dan 10; etil asetat; HCl pekat, 10 dan 1; pereaksi Dragendorff; pereaksi Mayer; aquadest; lempeng magnesium; butanol; eter; pereaksi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Liebermann – Burchard; FeCl 3 1; NaOH 1 N; petroleum eter; kloroform, eter, larutan buffer netral formalin, larutan untuk pembuatan preparat [Hematoksilin-Eosin, larutan Bouin asam pikrat, formaldehid 4, asam asetat, larutan xilol, Alkohol, Parafin] dan larutan George.

3.2.3. Hewan Uji

Hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan strain Sprague Dawley yang sehat dan fertil berumur 2,5 –3 bulan dengan berat badan 180–250 gram yang diperoleh dari peternakan Institut Pertanian Bogor.

3.3. RANCANGAN PENELITIAN

3.3.1. Besar Sampel

Penelitian ini bersifat eksperimental yang terbagi dalam 4 kelompok perlakuan yang masing –masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan strain Sprague Dawley WHO, 2000.

3.3.2. Dosis Perlakuan

Untuk perhitungan dosis yang diberikan dapat dilihat pada Lampiran 2. Pemberian ekstrak air dilakukan selama 48 hari sesuai dengan siklus spermatogenesis tikus Krinke, 2000. Tabel 3.1. Rancangan Percobaan Kelompok Jumlah Tikus Perlakuan Keterangan I kontrol 5 Tikus diberikan pembawa Na CMC 0.5 48 hari II dosis rendah 5 Tikus diberikan ekstrak air herba kemangi Ocimum americanum L. dalam Na CMC 0.5 dengan dosis 1 mgKgBB 48 hari III dosis sedang 5 Tikus diberikan ekstrak air herba kemangi Ocimum americanum L. dalam Na CMC 0.5 dengan dosis 10 mgKgBB 48 hari IV dosis tinggi 5 Tikus diberikan ekstrak air herba kemangi Ocimum americanum L. dalam Na CMC 0.5 dengan dosis 100 mgKgBB 48 hari UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4. PROSEDUR KERJA

3.4.1. Penyiapan Simplisia dan Pembuatan Ekstrak

Sebanyak 155 gr herba kemangi Ocimum americanum L. yang berwarna hijau segar. Herba kemangi yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih lalu dirajang kecil- kecil untuk diekstraksi dengan blender menggunakan pelarut air fresh pressed juice. Hasil ekstraksi kemudian disaring lalu dikeringkan dengan freezedryer selama 3-4 hari untuk menarik sisa kandungan air yangmasih terdapat didalam ekstrak. Nilai hasil rendemen ekstrak dihitung dengan rumus sebagai berikut : � = � � � � � � � � 100

3.4.2. Penapisan Fitokimia Ekstrak

1. Identifikasi Alkaloid Ekstrak dilarutkandengan HCl encer dan disaring. a. Uji mayer : Filtrat ditambahkan reagen mayer, terbentuk endapan berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid. b. Uji wagner : Filtrat ditambahkan reagen wagner, terbentuk endapan coklatkemerahan menunjukkan adanya alkaloid. c. Uji dragendroff : Filtrat ditambahkan reagen dragendroff, terbentuk endapan merah menunjukkan adanya alkaloid Tiwari et al., 2011. 2. Identifikasi Saponin, Uji busabath 0,5 g ekstrak ditambahkan 5 ml air suling dalam tabung reaksi. Larutandikocok kuat-kuat dan buih yang stabil diamati. Buih tersebut dicampur dengan 3 tetes minyak zaitun dan dikocok kuat-kuat setelah itu diamati apabila terjadi pembentukan emulsi.Ayoola et al., 2008 3. Identifikasi Flavonoid Ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH, terbentuk warna kuning yang pekat. Warna kuning menghilang bila dilakukan penambahan beberapa tetes asam encer menunjukkan adanya flavonoid Tiwari et al., 2011. 4. Identifikasi Tanin Sekitar 0,5 g ekstrak direbus dalam 10 ml air dalam tabung reaksi dan kemudian disaring. Beberapa tetes 0,1 feri klorida FeCl 3 ditambahkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan diamati dimana tannin terhidrolisa memberikan warna biru atau biru- hitam, sedangkan kondensasi tannin memberikan warna biru-hijau. Ayoola et al., 2008

3.4.3. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik

3.4.3.1. Parameter spesifik

Identitas ekstrak. Deskripsi tata nama :  Nama ekstrak generik, dagang, paten  Nama latin tumbuhan sistematika Botani  Bagian tumbuhan yang digunakan  Nama Indonesia tumbuhan. Depkes RI, 2000 Organoleptik. Penggunaan pancaindera mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut :  Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair.  Warna : kuning, coklat, dll.  Bau : aromatik, tidak berbau, dll.  Rasa : pahit, manis, kelat, dll.

3.4.3.2. Parameter non spesifik

a. Kadar abu Prosedur: Lebih kurang 2 g sampai 3 g ekstrak yang telah digerus dan ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas saring melalui kertas saring bebas abu. Pijar kan sisa kertas dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrate ke dalam krus, uap kan, pijar kan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Depkes RI, 2000 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.4. Penyiapan Hewan Coba

Tikus jantan diaklimatisasi di laboratorium farmakologi selama 1 minggu. Diberi makan dan minum secara ad libitum sesuai dengan kebutuhan serta ditimbang berat badannya.Ekstrak air herba kemangi diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari yaitu pada pagi hari selama 48 hari dengan dosis seperti yang tertera pada tabel rancangan percobaan Tabel 1. Pada hari ke-49 masing-masing kelompok tikus dibius dengan eter hingga tahap anestesi, kemudian dibedah dan diambil testis dan cauda epididimisnya.

3.4.5. Pembuatan Preparat

Setelah 48 hari, masing-masing hewan coba dikorbankan untuk diambil organ testisnya. Tikus dibius dengan eterhingga tahap anestesia pembedahan, kemudian dibedah. Diambil bagian cauda epididimis dan dihitung jumlah spermatozoa kemudian bagian testis diambil untuk ditimbang dan dibuat preparat. Pembuatan sediaan mikroanatomi testis dilakukan di Laboratorium Patologi AnatomiFakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Pembuatan preparat dilakukan dengan cara : testis yang telah diambil, difiksasi dalam larutan Bouin, kemudian didehidrasi dengan etanol seri bertingkat, dan pada akhirnya ditanamkan dalam paraffin wax. Blok paraffin dipotong dengan ketebalan 5µm dan dilakukan pewarnaan dengan hematosiklin –eosin Yotarlai et al., 2011.

3.4.6. Pengukuran Parameter

3.4.6.1. Morfologi Sperma

Sebanyak50 µl suspensi sperma dimasukkan ke tabung reaksi kemudian ditambahkan 300 µl eosin Y 1dan dicampur secara perlahan dengan menggunakan pipet. Sperma diinkubasi pada suhu kamar selama sekitar 45-60 menit untuk memaksimalkan pewarnaan Anonimous, 2000.

3.4.6.2. Bobot Testis

Pengukuran bobot testis dilakukan dengan cara menimbang organ testis dengan timbangan analitik kemudian hasil bobot testis tikus yang diberikan perlakuan dibandingkan dengan bobot testis tikus kontrol. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.6.3. Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa

Pengukuran konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada cauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan pada kaca arloji yang berisi cairan NaCl fisiologis 0.9 sebanyak 250 μL. Spermatozoa dimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2. Tabel 3.2. Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung No Jumlah spermatozoa dalam 1 kotak Pengenceran Kotak yang dihitung 1 40 50 kali 5 2 15 – 40 20 kali 10 3 15 10 kali 25 Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung Ilyas, 2007. Tabel 3.3. Cara pengenceran No Pengenceran Pembuatan pengenceran 1 50 kali a. 980 μL larutan George + 20 μL spermatozoa b. 2.450 μL larutan George + 50 μL spermatozoa 2 20 kali 950 μL larutan George + 50 μL spermatozoa 3 10 kali a. 900 μL larutan George + 100 μL spermatozoa b. 450 μL larutan George + 50 μL spermatozoa Poin a dan b menunjukan opsi perlakuan hanya salah satu yang dipilih. Setelah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel diatas. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus di bawah ini Ilyas, 2007. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta � = × 10.000 × � × 25 × � Keterangan: n adalah jumlah spermatozoa yang terhitung. Angka 10.000 merupakan volume kamar hitung Neubauer. Fp merupakan faktor pengenceran yang dilakukan. Angka 25 menunjukan total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer sedangkan k merupakan jumlah kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan. vNaCl merupakan volume NaCl mL fisiologis yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa dari vas deferens. Perhitungan konsentrasi spermatozoa JutamL dapat terlihat dari tabel 3.4 berikut. Tabel 3.4 . Rumus Konsentrasi Spermatozoa No Jumlah kotak yang dihitung Rumus konsentrasi spermatozoa 1 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,25 2 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,25 3 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,25 Dari perhitungan jumlah spermatozoa, dapat dihitung pula frekuensi timbulnya azoospermia. Azoospermia adalah suatu keadaan dimana tidak ada spermatozoa dalam cairan semen. Sedangkan oligozoospermia adalah suatu keadaan dimana terdapat sedikit spermatozoa dalam cairan semen spermatozoa ≤ 20 jutamL WHO, 1999. Penetapan timbulnya azoospermia dilakukan dengan cara membagi banyaknya individu yang mengalami azoospermia Az dengan banyaknya individu dalam satu kelompok n dikalikan 100 Kusmana, 2001. Persentase Azoospermia = x 100

3.4.6.4. Pengukuran Diameter Tubulus Seminiferus

Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali 10 x 10 kemudian difoto. Pengukuran diameter dilakukan pada 100 tubulus seminiferus yang terpotong bundar dan dipilih secara acak.

3.4.6.5. Tebal Sel Germinal

Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop denganpembesaran 100 kali 10 x 10 kemudian difoto. Pengukuran ketebalan sel germinal dilakukan pada 100 tubulus seminiferus yang terpotong bundar dan dipilih secara acak. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.5. RENCANA ANALISIS DATA

Hasil percobaan yang dianalisis untuk melihat adanya perbedaan yang nyata pada bobot testis, konsentrasi spermatozoa, ukuran diametertubulus seminiferus dari masing – masing kelompok perlakuan. Analisis data diolah menggunakan program pengolahan data statistik SPSS 16 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas, uji parametrik one- way ANOVA atau non parametrik Kruskal Wallis. Jika hasil dari uji ANOVA maupun Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang nyata p ≤ 0,05 maka analisis data dilanjutkan menggunakan uji Least Significant Difference LSD. 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

4.1.1. Determinasi

Berdasarkan hasil determinasi menunjukan bahwa sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah spesies Ocimum americanumL.famili Lamiaceae.

4.1.2. Karakterisasi Sampel

Herba kemangi yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Desa Grogol, Kecamatan Limo, Depok. Herba kemangi sebanyak 155 gram yang digunakan sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu dengan air mengalir kemudian diblender dengan aquades sebanyak 5 liter. Ekstrak air herba kemangi kemudian di freeze dry selama 88 jam 3-4 hari dan didapat bobot ekstrak sebesar 31 gram.

4.1.3. Hasil Uji Penapisan Fitokimia

Kandungan senyawa metabolit sekunder dari ekstrak air herba kemangi diidentifikasi dengan cara penapisan fitokimia. Kandungan yang diuji antara lain golongan flavonoid, golongan alkaloid, golongan tannin, dan golongan saponin. Hasil penapisan fitokimia ekstrak air herba kemangi dapat dilihat pada tabel 4.1. Tabel 4.1. Hasil Penapisan Fitokimia Golongan Hasil Flavonoid + Alkaloid - Tanin + Saponin -

4.1.4. Hasil Uji Parameter Spesifik dan Non Spesifik

Setelah dilakukan uji penapisan fitokimia pada ekstrak, dilakukan uji parameter spesifik dan non spesifik dilakukan terhadap ekstrak air herba kemangi, dimana uji parameter spesifik diantaranya adalah uji identitas ekstrak dan uji organoleptis sedangkan uji parameter non spesifik yang dilakukan adalah uji kadar abu. Hasil uji parameter spesifik dan non spesifik ekstrak air herba kemangi dapat dilihat pada tabel 4.2