24 diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 35°C selama 48±2 jam. Setelah
inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dihitung berdasarkan metode Bacteriological Analytical Manual BAM.
Perhitungan total mikroba dilakukan dengan berbagai ketentuan BAM 2001, antara lain:
a. Cawan yang normal berisi 25-250 koloni. Semua koloni dihitung termasuk
titik yang berukuran kecil. Pengenceran dan jumlah koloni semua dicatat untuk setiap cawan.
b. Cawan yang berisi lebih dari 250 koloni dicatat sebagai TBUD Terlalu
Banyak Untuk Dihitung. Jika tidak ada koloni yang tumbuh maka ditulis kurang dari 1 kali pengenceran terendah.
c. Rumus perhitungan yang digunakan adalah:
Dimana: N = jumlah koloni per ml per gram produk
Σ C = jumlah seluruh koloni yang dihitung n
1
= jumlah cawan pada pengenceran pertama n
2
= jumlah cawan pada pengenceran kedua D = pengenceran pertama yang dihitung
1.3. Analisa Salmonella BAM, 2007
1.3.1. Pre enrichment Pra Pengkayaan
Sebanyak 25 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam kantung plastik steril. Ke dalam plastik tersebut dimasukkan 225 ml
Lactose Broth steril dan dihancurkan dengan menggunakan stomacher
selama 120 detik. Sampel yang telah dihancurkan dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril dan dibiarkan selama 60 ± 5 menit pada suhu ruang
dalam keadaan tertutup kemudian diinkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 35 ± 2°C.
25
1.3.2. Selective Enrichment Pengkayaan Selektif
Sebanyak 1 ml sampel dari Lactose Broth yang telah diinkubasi diinokulasikan ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth TTB dan divorteks,
kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam.
Sebanyak 0.1 ml dari sampel yang sama diinokulasikan ke dalam 10 ml Rappaport Vassiliadis RV Broth dan divorteks, kemudian diinkubasi
pada suhu 42 ± 2°C selama 24 ± 2 jam.
1.3.3. Isolasi Salmonella dengan agar selektif
Sampel yang telah diinkubasi pada masing-masing media pengkayaan selektif diambil satu ose dan digoreskan secara kuadran pada media Xylose
Lysine Desoxycholate Agar XLDA, Hektoen Enteric Agar HEA, dan
Bismuth Sulfite Agar BSA. Sebelum digores, media pengkayaan selektif
divorteks terlebih dahulu. Ketiga agar selektif tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam. Setelah inkubasi, dilihat
apakah ada koloni tipikal yang tumbuh pada masing-masing agar. Ciri-ciri koloni tipikal Salmonella pada masing-masing agar sebagai berikut:
a. Pada media HEA, koloni berwarna biru kehijauan, dengan atau tanpa
warna hitam di tengahnya, beberapa akan tampak sebagai koloni yang besar, berwarna hitam mengkilap di tengahnya atau tampak sebagai
koloni yang semuanya berwarna hitam b.
Pada media XLDA, koloni berwarna merah muda dengan atau tanpa warna hitam di tengahnya, beberapa akan tampak sebagai koloni yang
besar, berwarna hitam mengkilap di tengahnya atau tampak sebagai koloni yang semuanya berwarna hitam
c. Pada media BSA, koloni berwarna coklat, abu-abu atau hitam, kadang
tampak berwarna kilau metalik. Sekeliling koloni biasanya akan berwarna coklat pada awalnya dan akan menjadi hitam dengan
bertambahnya waktu inkubasi, yang disebut halo effect.
26 Apabila terdapat koloni tipikal yang tumbuh maka analisa dilanjutkan
dengan uji biokimia awal dengan menggunakan Triple Sugar Iron Agar TSIA dan Lysine Iron Agar LIA.
Jika koloni tipikal Salmonella tidak ada, dicari koloni Salmonella yang tidak tipikal sebagai berikut:
a. Pada media HEA dan XLDA, beberapa kultur Salmonella yang tidak tipikal memproduksi koloni kuning dengan atau tanpa warna hitam di
tengahnya. Jika koloni yang tipikal tidak muncul setelah inkubasi 24 ± 2 jam, diambil 2 atau lebih koloni yang tidak tipikal tersebut.
b. Pada media BSA, beberapa galur yang tidak tipikal memproduksi koloni hijau dengan sedikit atau tanpa dikelilingi warna gelap pada
media. Jika tidak terdapat koloni yang tipikal maka tidak diambil koloninya, tetapi diinkubasi lagi selama 24 ± 2 jam. Jika koloni yang
tipikal belum muncul juga maka koloni yang tidak tipikal diambil setelah diinkubasi 48 ± 2 jam.
1.3.4. Uji Biokimia Awal
