UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dicampur dengan 9 mL Nutrient Broth sehingga didapatkan suspensi dengan kepadatan 10
6
CFUmL Lanawati,dkk., 2003; Dewanti,dkk., 2011; Wahyu, dkk., 2013.
3.3.10. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Sebanyak satu ose bakteri pada Nutrient Agar miring, difiksasi di atas kaca objek yang bersih. Olesan bakteri ditambahkan dengan Gentian violet dalam keadaan
berlebih, lalu dibiarkan satu menit. Zat warna yang berlebih dibuang, lalu kaca obyek dibilas dengan air mengalir. Preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering,
larutan lugol berlebih ditambahkan ke permukaan preparat tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, preparat dibilas dengan air mengalir. Preparat dibilas
dengan alkohol 96 sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air mengalir. Preparat dikeringkan di atas nyala api spiritus. Setelah kering, safranin
berlebih ditambahkan ke permukaan preparat dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat ditambahkan satu tetes minyak
imersi dan diamati menggunakan mikroskop Olympus CX21 dengan perbesaran 100X Yuli,dkk., 2012; Sulistiyaningsih, 2008.
3.3.11. Pengujian Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram
Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode agar dengan cakram. Cakram silinder steril yang digunakan berdiameter 6 mm. Media cair agar NA steril
dituangkan secara aseptis sebanyak 20,0 mL pada cawan petri berdiameter 9 cm steril hingga merata, kemudian dibiarkan hingga membeku. Selanjutnya, suspensi bakteri
Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa yang sudah distandardisasi kekeruhannya, dicelupkan kapas lidi steril, ditunggu sebentar agar cairan meresap ke
dalam kapas. Kemudian lidi diangkat dan diperas dengan cara menekankan lidi pada dinding tabung bagian dalam sambil diputar-putar. Digores-goreskan kapas lidi pada
permukaan media NA hingga seluruh permukaan tertutup rapat dengan goresan- goresan. Media NA dibiarkan selama 5-15 menit agar suspensi bakteri meresap ke
dalam agar. Lalu 100 L larutan asap cair dengan pengenceran 0 kali, 10 kali dan 50
kali diteteskan pada cakram silinder. Diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam.
Setelah inkubasi daya antibakteri yang terjadi ditentukan dengan mengukur diameter
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
daerah hambat pertumbuhan dengan menggunakan jangka sorong. Untuk selanjutnya dipilih satu suhu pirolisa asap cair yang mempunyai aktivitas antibakterial paling
besar terhadap kedua kultur bakteri untuk digunakan pada penilitian tahap selanjutnya Marliana, dkk., 2011; Lanawati, dkk., 2003; Wayan, dkk., 2012.
3.3.12. Pengujian Daya Hambat Antibakteri
Untuk mencari KHM dilakukan dengan metode dilusi tabung yang mana ketentuannya sebagai berikut: Terdapat 9 tabung, dimana tabung 1-7 merupakan
tabung untuk pengujian, sedangkan tabung 8 sebagai kontrol positif , tabung 9 kontrol sterilitas berisi aquadest steril, tabung 10 kontrol medium NB, tabung 11 kontrol
bakteri tanpa asap cairperlakuan. Serta terdapat 1 larutan stok asap cair dengan nilai pengenceran yaitu 10 kali 10.
a Tabung 1-7 berisi 0,5 mL media NB steril b Kemudian tabung 1 ditambahkan dengan 0,5 mL larutan stok asap cair dan
campuran dalam tabung dikocok perlahan untuk menghomogenkan. c 0,5 mL campuran larutan pada tabung 1 dipipet dan ditambahkan pada tabung
2, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. d 0,5 mL campuran larutan pada tabung 2 dipipet dan ditambakan pada tabung
3, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. e 0,5 mL campuran larutan pada tabung 3 dipipet dan ditambahkan pada tabung
4, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. f 0,5 mL campuran larutan pada tabung 4 dipipet dan ditambahkan pada tabung
5, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. g 0,5 mL campuran larutan pada tabung 5 dipipet dan ditambahkan pada tabung
6, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. h 0,5 mL campuran larutan pada tabung 6 dipipet dan ditambahkan pada tabung
7, dikocok perlahan untuk menghomogenkan. i 0,5 mL campuran larutan larutan pada tabung 7 dipipet dan
dibuangdipisahkan. j Masing-masing tabung dengan nomor 1-7, selanjutnya ditambahkan dengan
0,1 mL suspensi bakteri 10
6
CFUmL dan ditambahkan dengan 0,4 mL media
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Nutrient Broth sehingga volume total masing-masing tabung adalah 1 mL. Tabung 1-7 kemudian selanjutnya, diinkubasi pada suhu 37
C selama 18-24 jam. Kemudian diamati ada tidaknya kekeruhan larutan uji dengan mata
telanjang dibandingkan dengan kontrol. Untuk sampel yang akan diuji yaitu Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Konsentrasi terkecil
pertama yang menunjukkan kejernihan tidak adanya pertumbuhan bakteri merupakan KHM dari asap cair tempurung kelapa sawit.
3.3.13. Analisis Kerusakan Sel Menggunakan SEM Scanning Electron
