Gambar 5 Hati ikan normal, hepatosit dengan sitoplasma granular, dan inti pusat yang berbentuk bulat panah skala bar 10 mm, H.E. Camargo
dan Martinez 2007.
Hati juga merupakan organ vital yang berfungsi sebagai detoksifikasi dan mensekresikan bahan kimia yang digunakan untuk proses pencernaan. Hati
berperan penting dalam proses metabolisme dan transformasi bahan pencemar dari lingkungan. Dengan demikian hati merupakan organ yang paling banyak
mengakumulasi zat toksik sehingga mudah terkena efek toksik. Sebagian zat toksik yang masuk ke dalam tubuh setelah diserap oleh sel akan dibawa ke hati
oleh vena porta hati sehingga hati berpotensi mengalami kerusakan. Adanya zat toksik akan mempengaruhi struktur histologi hati sehingga dapat mengakibatkan
patologis hati seperti pembengkakan sel, rangkaian nekrosis atau bridging necrosis, degenarasi intralobular dan fokal nekrosis, fibrosis, serta cirrhosis
Camargo dan Martinez 2007.
2.6 Histologi
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu histos yang berarti jaringan dan logos yang berarti ilmu. Jadi histologi berarti suatu ilmu yang menguraikan
struktur dari hewan secara terperinci dan hubungan antara struktur pengorganisasian sel dan jaringan serta fungsi-fungsinya. Jaringan merupakan
sekumpulan sel yang tersimpan dalam suatu kerangka struktur atau matriks yang mempunyai suatu kesatuan organisasi yang mampu mempertahankan keutuhan
dan penyesuaian terhadap lingkungan diluar batas dirinya Bavelander
1998.
Sajian histologi merupakan suatu irisan jaringan yang sangat tipis, yang cocok untuk dipelajari di bawah mikroskop cahaya atau mikroskop elektron.
Sajian ini berfungsi sebagai pengamatan sesaat terhadap apa yang terjadi pada saat itu di dalam jaringan. Sajian yang akan diamati dengan mikroskop cahaya harus
cukup tipis agar cukup ditembus cahaya dan menghindarkan tumpang tindih visual oleh berbagai unsurnya. Untuk mikroskopi cahaya biasanya sajian dibuat
dengan teknik parafin Cormack 1992. Mikroteknik adalah ilmu yang mempelajari tentang pembuatan preparat.
Setiap pembuatan preparat pada umumnya selalu dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Fiksasi itu sendiri adalah suatu cara atau proses metode yang bertujuan
untuk mematikan sel tanpa mengubah fungsi dan struktur di dalam sel itu sendiri. Jika telah dilakukan fiksasi maka preparat yang dibuat akan menjadi lebih awet
dan tahan lama Kiernan 1990.
2.7 Pemeriksaan Histologi
Histologi merupakan salah satu cabang ilmu yang mempelajari tentang organ atau bagian tubuh hewan atau tumbuhan secara cermat dan rinci. Upaya
untuk mengamati, mempelajari serta meneliti jaringan-jaringan dari organisme tertentu dapat dilakukan dengan cara pembuatan spesimen atau preparat histologi.
Menurut Davenport 1960 diacu dalam Gunarso 1986 penyiapan spesimen histologi secara umum dilakukan dengan 4 cara, yaitu:
1 penyiapan preparatspesimen secara keseluruhan whole mount, yaitu
pengamatan perkembangan embrio dan lain sebagainya; 2
penyiapan spesimen dengan metode penyayatan sectioning methods; 3
penyiapan dengan metode remasan teasingsquashing methods; 4
penyiapan dengan menggunakan metode ulasan smear methods. Metode penyayatan sectioning adalah suatu metode yang banyak
digunakan dalam penyiapan spesimen histologi. Metode ini dilakukan dengan menyayat spesimen hingga sangat tipis, kemudian diwarnai dan dijadikan
spesimen awetan. Penyayatan dilakukan menggunakan mikrotom. Spesimen dilakukan perlakuan pengerasan agar memudahkan dalam penyayatan. Pengerasan
jaringan dilakukan dengan cara membekukan atau dengan penanaman dalam suatu
substansi yang mampu mengeraskannya Davenport 1960 diacu dalam Gunarso 1986.
Pembuatan preparat dengan metode parafin merupakan suatu metode yang paling umum digunakan. Metode ini banyak digunakan karena pembuatannya
lebih mudah dan lebih cepat serta material kering dapat disimpan lebih lama Kiernan 1990. Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik
tumbuhan ataupun hewan menggunakan parafin. Kelebihan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Tebal
irisan dengan metode beku rata-rata diatas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan
yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut, dan
mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan dengan menggunakan metode ini karena sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada
jaringan akan larut Kiernan 1990. Langkah-langkah dalam teknik histologi secara manual adalah fiksasi atau
pengawetan jaringan, perlakuan processing jaringan, pemotongan jaringan, pewarnaan jaringan, serta pengamatan menggunakan mikroskop Angka et al.
1990. Tahapan dalam persiapan preparat adalah fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi dan embedding, blocking dan trimming, pemotongan, pewarnaan, dan
perekatan jaringan. Fiksasi merupakan tahap awal pembuatan preparat histologi yang dilakukan
untuk mencegah autolisis dan dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau organ. Selain itu, fiksasi akan membuat padat suatu jaringan lunak. Hal ini
disebabkan karena bahan fiksatif akan mengkoagulasi protein dalam sel dan jaringan. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi
jaringan sehingga jaringan tetap, seperti keadaan semula sewaktu hidup, serta memudahkan pemulasan atau pewarnaan jaringan yang akan dilakukan pada
tahapan selanjutnya Cormack 1992. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis
antara lain: tebal irisan jaringan 3-5 mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat memfiksasi seluruh jaringan, volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya
harus 15-20x volume jaringan yang akan difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan
kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan, dan jenis cairan fiksasi yang akan digunakan
bergantung kepada unsur jaringan yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan praktis, cairan fiksasi dapat
dibedakan menjadi 3 kelompok, yaitu micro-anatomical fixation, cytological fixatives, dan histochemical fixatives Kiernan 1990.
Larutan fiksasi disebut fiksatif. Beberapa fiksatif yang dapat digunakan antara lain fiksatif Zenker, fiksatif
Clarke’s, fiksatif Carnoys, Buffer Normal Formalin BNF, fiksatif Alcohol-formalin-acetic mixtures, larutan
Bouin’s, Larutan
Helly’s, fiksatif Altmann’s, larutan Gendre’s dan fiksatif Heidenhain ‘s Kiernan 1990. Formula fiksatif BNF adalah Kiernan 1990:
Sodium phosphate NaH
2
PO
4
.H2O : 4,0 g
Na
2
HPO
4
anhidrid : 6,5 g
Akuades : 900 ml
Formaldehid 37-40 : 100 ml
Waktu minimum yang dibutuhkan untuk jaringan dalam fiksatif ini adalah 24 jam dan maksimum 1 minggu. Konsentrasi formaldehid tidak terlalu
berpengaruh, dan berkisar dari 2,5-10. Fiksasi dilakukan dengan cara membenamkan potongan kecil jaringan ke dalam larutan fiksatif. Pengambilan
jaringan dilakukan dengan pisau yang tajam. Hal ini bertujuan untuk menghindari kerusakan pada jaringan Genesser 1994.
Tabel 1 Kelebihan dan kekurangan berbagai larutan pengawet
Larutan Pengawet
Kelebihan Kekurangan
Formalin Cairan pengawet umum, pH netral,
potongan jaringan dapat ditinggalkan dalam pengawet tanpa terjadi
perubahan berarti sampai 1 tahun Waktu perendaman 24 jam,
terjadi pengerutan jaringan
Muller Daya penetrasi cepat dan baik,
memfiksasi nukleus dan sitoplasma dengan baik
Jika sampel direndam dalam pengawet 24 jam, jaringan
menjadi rapuh, tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan
metode histokimia, harus dicuci dulu dengan air kran mengalir
sebelum dilakukan dehidrasi
Bouin Daya penetrasi cepat dan merata tetapi
menyebabkan pengerutan, memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan
metode trichrome, sangat baik untuk nukleus dan kromoson, warna kuning
membuat jaringan mudah dilihat saat perendaman dan pengirisan jaringan
Bila direndam dalam pengawet 24 jam, jaringan menjadi
rapuh, harus dicuci dulu dengan air kran untuk menghilangkan
kelebihan pikrat
Zenker Formol
Cairan Helly
Daya fiksasi cepat dan kuat, sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang,
limpa dan organ lain yang banyak mengandung darah, warna sitoplasma
menjadi lebih cemerlang Pemaparan jaringan dalam
larutan yang melebihi waktu yang ditentukan mengakibatkan
jaringan rapuh
Sumber: Kiernan 1990
Proses dehidrasi dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan air atau menarik cairan yang ada dalam jaringan setelah proses fiksasi dan digantikan
parafin. Kandungan air yang tinggi akan menghambat proses selanjutnya. Cairan dalam jaringan akan menyebabkan jaringan menjadi lunak, berisi lumen dan
mudah rusak saat penyayatan Sass 1951. Clearing merupakan suatu proses penjernihan yang bertujuan untuk
menggantikan alkohol. Proses clearing dilakukan dengan menambahkan clearing agent yang berfungsi untuk melarutkan parafin. Pada proses ini jaringan menjadi
jernih dan transparan sehingga tidak tertembus cahaya. Bahan yang dapat digunakan sebagai clearing agent, yaitu xylol, kloroform, dan benzol. Xylol
banyak digunakan karena bekerja dengan cepat, membuat preparat cukup transparan dan bersifat dealkoholisasi Sastrohadinoto et al. 1973. Menurut
Angka et al 1990, Setelah dilakukan proses dehidrasi, air di dalam sel akan keluar. Bagian yang kosong akan terisi parafin agar jaringan terikat kuat dengan
parafin. Alkohol tidak dapat melarutkan parafin, oleh sebab itu digunakan xylol yang dapat melarutkan parafin dan dapat bercampur dengan alkohol.
Impregnasi merupakan proses pemasukan medium tanam ke dalam jaringan secara bertahap. Medium yang digunakan untuk menanam adalah parafin.
Embedding adalah proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam jaringan. Proses ini berlangsung di dalam oven pada suhu 60
o
C karena titik cair parafin pada suhu 54
o
C-58
o
C. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat
dilakukan pemotongan Angka et al. 1990. Pada suhu yang lebih tinggi dari titik cair parafin sisa-sisa dehidratant dan clearing agent akan lebih cepat menguap
Sastrohadinoto et al. 1973. Proses pembenaman ke dalam parafin membantu memudahkan pemotongan jaringan yang sangat tipis.
Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair lalu diblok dicetak agar mudah dipotong dengan parafin cair yang kemudian
dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm
3
. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 18 bagian cetakan dan dibiarkan hingga
sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu
ruang selama 24 jam Angka et al. 1990. Blok parafin dikeluarkan dari cetakan setelah mengeras dan ditriming
menggunakan silet. Tujuan dilakukannya trimming yakni membuang parafin yang berlebihan, mengatur bentuk potongannya agar rapi dan agar dapat disesuaikan
dengan tempat blok alat pemotong Sastrohadinoto et al. 1973, Angka et al. 1990.
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan pisau khusus yaitu mikrotom. Alat ini dilengkapi dengan pisau yang sangat tajam dan ketebalan
irisan yang diingikan. Menurut Kiernan 1990 mikrotom ada beberapa macam yaitu :
1 Mikrotom geser sliding mikrotome.
Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser
adalah jaringan yang tanpa penanaman embedding terlebih dulu. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa
warna terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2 Mikrotom beku freezing microtome.
Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO
2
dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap
berada pada tempatnya sedangkan pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang. Fiksasi dapat dijalankan setelah pemotongan dan sebelum
pewarnaan. 3
Mikrotom putar rotary microtome. Mikrotom ini letak pisau tetap pada tempatnya, sedangkan jaringannya yang
bergerak ke atas dan ke bawah. Hal inilah yang membedakan mikrotom ini dengan kedua jenis mikrotom di atas. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan
untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin. Sayatan untuk jaringan keras dengan ketebalan 7-8 µm, sedangkan untuk
jaringan lunak seperti daging, hati, ginjal dan lain-lain ketebalannya 5-6 µm. Pita parafin diletakkan di permukaan air hangatwaterbath 45
o
C-50
o
C. Hal ini bertujuan agar jaringan di dalam parafin teregang. Pita parafin diangkat dari
permukaan air dengan menggunakan slide yang sebelumnya telah direndam di dalam metanol. Perendaman ini bertujuan untuk membersihkan kotoran yang
menempel pada slide. Preparat yang telah merekat pada slide dibiarkan hingga mengering.
Pewarnaan dilakukan dengan melekatkan irisan jaringan pada kaca obyek. Sebelum pewarnaan harus dilakukan penghilangan parafin yang ada di dalam
jaringan menggunakan xilene xylol kemudian dilakukan hidrasi dengan konsentrasi alkohol yang menurun, yaitu alkohol 100, 100, 95, 90, 80,
70, dan 50 masing-masing selama 3 menit. Penghilangan parafin bertujuan agar jaringan menjadi jernih Angka et al. 1990.
Pewarnaan histologi pada umumnya menggunakan kombinasi hematoksilin dan eosin HE. Hematoksilin dan eosin adalah metode pewarnaan yang berfungsi
ganda. Pertama memungkinkan pengenalan komponen jaringan tertentu dengan cara memulasnya secara differensial. Kedua, dapat memulas dengan tingkat atau
derajat warna berbeda yang menghasilkan kedalaman pulasan yang berbeda. Hematoksilin berasal dari ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree.
Pada pulasan H E, kompleks warna hemaktosilin berwarna ungu tua. Pewarna eosin memberikan warna merah muda sampai merah pada komponen jaringan
yang tidak terpulas ungu-biru oleh hemaktosilin. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa. Zat ini mewarnai unsur basofilik pada jaringan. Eosin bersifat asam
serta memulas komponen asidofilik pada jaringan Cormack 1992. Mounting adalah suatu proses perekatan sayatan jaringan pada kaca sediaan
menggunakan bahan perekat adhesive. Proses mounting dilakukan menggunakan mounting media. Mounting media merupakan zat pengisi antara preparat yang
telah diwarnai dengan kaca penutup. Terdapat dua jenis mounting media, yaitu dalam bentuk resin dan cairan. Resin media terdiri dari tiga tipe, yaitu alami, semi
sintetis, dan sintetis sepenuhnya. Contoh resin media adalah Canada Balsam. Canada balsam merupakan mounting alami yang terdiri dari komponen volatil,
yaitu resin yang merupakan cairan kental berwarna kuning dan meleleh ketika dipanaskan. Balsam yang dikeringkan akan berbentuk padat dan harus
ditambahkan xylene sehingga dapat digunakan sebagai mounting media. Komponen tak jenuh dalam resin membuat Canada balsam sebagai agen
pereduksi ringan. Oleh karena itu, media Canada balsam dapat mempertahankan warna pada preparat awetan histologi lebih dari satu bulan atau satu tahun. Contoh
mounting media dalam bentuk cairan, antara lain Gliserol jelly, Buffer gliserol dengan PDD, fructose syrup, dan Apat
hy’s medium Cormack 1992. Penutupan kaca obyek dilakukan dengan menutupkan kaca penutup di atas
sajian, sehingga apabila xylol dalam media penjernih menguap maka kaca penutup melekat erat dengan kaca obyek. Hal ini dilakukan agar permukaan yang
dihasilkan tidak menyebabkan pantulan cahaya selama pengamatan mikroskopis Geneser 1994.
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
