18 selama 24 jam. Aktivitas penghambatan dihitung berdasarkan diameter penghambatan
terhadap bakteri uji yang membentuk zona bening dan diukur menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,05 mm. Tahap ini dilakukan secara duplo dengan tiga kali ulangan.
Zona penghambatan d = 2r yang diukur adalah diameter zona bening dikurangi dengan diameter sumur. Semakin lebar diameter penghambatan, maka aktivitas senyawa antimikroba
semakin besar. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas penghambatan terkuat akan dipilih untuk tahap penelitian selanjutnya. Tahap pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi
sumur dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur
5. Pengujian aktivitas penghambatan dengan metode dillution broth
Pengujian aktivitas penghambatan mengacu pada Radiati 2002 dengan metode dillution broth menggunakan media NB. Pengujian aktivitas penghambatan dilakukan pada ekstrak
jahe yang memiliki aktivitas antimikroba tertinggi terhadap bakteri uji. Konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 0, 5, 10, 15, 20 mgml untuk bakteri uji yang
menunjukkan penghambatan pada difusi sumur. Kisaran konsentrasi mengacu pendekatan yang dilakukan oleh Radiati 2002 yang menemukan bahwa pada kisaran konsentrasi
tersebut terdapat konsentrasi hambat minimal MIC untuk bakteri uji yaitu dengan menggunakan ekstrak semi-polar diklorometan yang diperoleh dari maserasi bertingkat
dapat menghambat bakteri S. Typhi sebesar 10 mgml. Tahap pengujian aktivitas penghambatan dapat dilihat pada Gambar 15 yaitu ekstrak jahe
terpilih dibuat larutan stok sebesar 40 mg ekstrak ml DMSO ditambah ke dalam tabung berisi inokulum bakteri uji yang mengandung campuran antara media NB. Selanjutnya kultur
diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Subkultur ditumbuhkan pada media NA pada inkubasi 0 jam dan setelah inkubasi 24 jam dengan kisaran pengenceran antara 10
3
– 10
8
. Perhitungan konsentrasi ekstrak etil asetat menggunakan rumus:
Diukur diameter penghambatan dengan jangka sorong diameter zona bening dikurangi dengan diameter sumur
Keterangan: a,b,c = ekstrak jahe konsentrasi 100 mgml DMSO heksan,
etil asetat, etanol d= kloramfenikol100µgml air steril wv kontrol positif
e= pelarut DMSO kontrol negatif
Diinkubasi suhu 37
o
C 24 jam 20 ml NA cair
Diinokulasi dengan bakteri uji berkisar 10
5
CFUml Dibuat sumur diameter ± 5 mm
sumur ditetesi 60 µl ekstrak dengan konsentrasi 100 mg ekstrakml sampel bakteri uji duplo dan ulangan 3x
d a
c b
e
19
M
1
V
1
= M
2
V
Keterangan:
2
M
1
V = 40 larutan stok stok mgml DMSO
1
M = volume ekstrak yang ditambahkan ml
2
V = konsentrasi ekstrak yang dikehendaki mgml
2
Penghitungan jumlah ekstrak etil asetat 40 yang diambil untuk mendapatkan masing- masing volume ekstrak sebagai berikut Tabel 9:
= volume total saat inkubasi 10 ml
Contoh: M
2
40 x V = 5
1
V = 5 x 10 ml
1
= 1,25 ml Tabel 9. Kombinasi konsentrasi pengujian aktivitas penghambatan metode dillution broth
Konsentrasi ekstrak M
2
Ekstrak yang ditambahkan
ml V
1
Kultur ml NB ml
Volume total saat inkubasi ml
V
2
5 1,25
1 7,75
10 10
2,50 1
6,50 10
15 3,75
1 5,25
10 20
5,00 1
4,00 10
Keterangan: V
NB
= V
2
– V
kultur
– V
1
ml Penurunan jumlah pertumbuhan bakteri ditentukan dengan menghitung persentase selisih
jumlah koloni yang tumbuh setelah 24 jam dengan jumlah koloni yang tumbuh pada 0 jam dibagi jumlah koloni yang tumbuh pada 0 jam. Nilai konsentrasi ekstrak jahe yang
menunjukkan penurunan jumlah bakteri sebesar 90 merupakan nilai konsentrasi hambat minimal MIC.
Gambar 15. Pengujian aktivitas penghambatan dengan metode dillution broth 5
10 15
20 Diinokulasi dgn bakteri uji s.d tabung 10
5
CFUml
Ditumbuhkan dalam cawan dengan pengenceran antara
10
3
- 10
8
Diamati Diinkubasi 37
o
C 24 jam Ditambahkan dalam media NB
Dilarutkan dalam DMSO Ekstrak
terpilih
Konsentrasi ekstrak jahe yang ditambahkan mgml
Ditumbuhkan dalam cawan dengan pengenceran antara
10
3
-10
8
Diamati
20
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. PERSIAPAN KULTUR BAKTERI UJI
