12 n
= jumlah titik pertemuan orangutan kalimantan yang ada pada satu klasifikasi kesesuaian
N = jumlah total titik pertemuan orangutan kalimantan hasil survey
2.5 Tahapan Untuk Analisis DNA
Penelitian dilakukan dengan menggunakan sampel rambut dari sarang orangutan yang tersebar mulai dari TNBK, koridor dan TNDS. Sampel diambil
secara non invasive atau sampel diambil tanpa berjumpa langsung dengan satwa yang menjadi obyek penelitian Taberlet et.al 1999. Sampel rambut yang berhasil
dikumpulkan dimasukkan kedalam kantong plastik kecil yang bisa disegel dan dimasukkan ke dalam amplop kertas, dan diberi catatan lengkap.
Sampel DNA Orangutan diambil secara langsung dari pusat rehabilitasi di Kabupaten Sintang yang dikelola oleh Yayasan Kobus dan di Kabupaten Ketapang
yang dikelola oleh IAR International Animal Rescue Indonesia Kalimantan Barat berupa sampel darah dan rambut invasive dan non invasive. Sampel ini diambil
dengan tujuan memverifikasi
1. Karakteristik berdasarkan asal-usul dan sebaran orangutan yang ada di pusat rehabilitasi
2. Sinkronisasi data lapang dan gen bank dengan sebaran di tempat penelitian. Untuk sampel darah dimasukkan ke dalam tabung berukuran 15 ml, sampel
darah diambil sebanyak 1-2 ml., kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang telah diisi larutan ethanol absolut sebanyak 3 ml. Selanjutnya segera dilakukan
pengocokkan sehingga sampel darah larut dan tercampur dengan ethanol absolute. Setelah tercampur merata ditambah larutan ethanol lagi sampai penuh, dan
disimpan di tempat penyimpanan pada suhu kamar Duryadi pers. comm.. Sampel dianalisis di Laboratorium Biologi Molekuler-PPSHB IPB Bogor.
1 Ekstraksi sampel DNA total
Isolasi DNA mengikuti Duryadi pers. comm. 2012, yaitu dengan mengambil sampel darah yang telah direndam dalam ethanol absolute, masukkan kedalam
tabung ependorf 1,5 ml, selanjutnya masukkan larutan low TE sebanyak 1 000 ul sentrifuge 6 500 rpm selama 5 menit lakukan sebanyak 2 kali. Kering udarakan
dengan menggunakan kertas saring pada suhu ruangan. Ambil sampel yang telah kering ini sebanyak 250 mg dan masukkan kedalam ependorf yang baru. Gerus
dengan menggunakan pistil sambil tambahkan buffer ATL sebanyak 180 ul ke dalam tabung. Tambahkan proteinase K sebanyak 20 ul ke dalam tabung tadi.
Inkubasi pada suhu 56
o
C sedikitnya 1 jam dan lakukan vortex selama 10 detik setiap 10 menit. Setelah selesai angkat tabung dan swing sebentar, tambahkan
buffer AL sebanyak 200 ul, dan vortex selama 10 detik, swing sebentar. Tambahkan ethanol absolute sebanyak 50 ul, vortex selama 15 detik, inkubasi pada
suhu ruangan selama 3 menit, swing sebentar. Selanjutnya ambil supernatant dan masukkan kedalam spin kolom QIAamp MinElute 2 ml, sentrifuge 8 000 rpm
selama 1 menit, buang larutan hasil sentrifuge.
Tambahkan larutan buffer AW1 sebanyak 500 ul ke dalam spin kolom, sentrifuge 8 000 rpm selama 1 menit, dan buang larutan yang dihasilkan. Secara
hati-hati buka tutup spin kolom dan tambahkan larutan buffer AW2 sebanyak 500 ul ke dalam spin kolom, sentrifuge 8 000 rpm selama 1 menit, dan buang larutan
yang dihasilkan. Selanjutnya tambahkan ethanol absolute sebanyak 700 ul dan sentrifuge 800 rpm selama 1 menit, dan buang larutan yang dihasilkan.
13 Sentrifuge pada kecepatan tinggi yaitu 14.000 rpm selama 3 menit untuk
mengeringkan membran pada spin kolom secara sempurna, kemudian tempatkan kolom pada tabung ependorf 1,5 ml yang baru, buka tutup kolom dan inkubasi pada
suhu ruangan selama 10 menit atau pada suhu 56
o
C selama 3 menit. Tambahkan 20- 100 ul Elution Buffer, biarkan pada suhu kamar selama 10-15 menit, dan sentrifuge
pada kecepatan tinggi 14 000 rpm selama 1 menit. Hasil akhir bisa langsung dilakukan elektroforesis atau bisa disimpan dalam freezer.
Untuk isolasi DNA dari rambut menggunakan metode berikut Duryadi pers.comm sampel rambut diambil sedikitnya 10 helai dan dipotong sepanjang 0,5-
1 cm dari pangkal rambut yang berfolikel, masukkan kedalam tabung 1,5 ml tambahkan larutan campuran buffer dan DTT sebanyak 100 ul inkubasi selama 2
jam pada suhu 38
o
C, kemudian tambahkan larutan inkubasi lengkap incubation buffer + DTT + Proteinase K sebanyak 100 ul, kocok untuk homogenisasi dan
inkubasi semalam dengan sesekali dilakukan vortex. Selanjutnya tambahkan larutan lisis buffer AL sebanyak 100 ul dan putar manual selama 30 menit kemudian
diinkubasi pada suhu 70
o
C selama 15 menit, setelah itu di putar dengan mesin sentrifuse sebentar dan ambil supernatant untuk ditempatkan kedalam tabung yang
baru. Pada tabung ini kemudian ditambahkan larutan ethanol absolute sebanyak 500 ul dan dinginkan selama 2 jam. Dari pendingin kemudian di putar sebentar dan
larutan diambil dimasukkan kedalam spin kolom, dan diputar dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit, larutan yang didapat dibuang, kemudian tambahkan
larutan AW1 sebanyak 500 ul dan diputar dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit dan larutan yang dihasilkan dibuang. Tahapan selanjutnya adalah
menambahkan larutan AW2 sebanyak 700 ul kemudian diputar dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit dan larutan yang didapat dibuang, untuk mengeringkan
membrane pada spin kolom dilakukan pemutaran lagi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 3 menit. Berikutnya masukkan spin kolom ke tabung baru secara hati-hati
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang, tambahkan larutan elusi AEelution buffer sebanyak 50 ul dan dibiarkan selama 15 menit kemudian diputar
dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit, penambahan larutan elusi dilakukan sebanyak dua kali. DNA total yang didapat kemudian dilihat kualitasnya dengan
dimigrasikan pada gel agarosa 1,2 dengan menggunakan buffer 1xTBE 89 mM Tris, 89mM asam borat dan 2mM EDTA, pH8 dalam alat Submarine
Electrophoresis
Hoefer, USA. Pengamatan dilakukan dengan bantuan sinar UV λ = 200-400 nm setelah gel diwarnai dengan Ethidium Bromida 0,5 μ gml.
2 Amplifikasi DNA
DNA yang telah diekstraksi digunakan sebagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi. Amplifikasi fragmen DNA di daerah D-loop mitokondria dan sexing
individu dilakukan dengan membuat 25μ l campuran larutan yang terdiri dari ddH
2
O 6,8 μ l, buffer 5 μ l, enhancer 5μ l, 10mM dNTPs 1μ l, primer F 20-100 pm1μ l, primer R 20-100 pm1μ l, DNA template 5 μ l dan Taq polymerase
1,25U, 0,2 μ l, Bio lab, Pencampuran dilakukan secara berurutan, kemudian sentrifuse sebentar ± 20 detik. Primer yang digunakan yaitu untuk forward
menggunakan OH-F 5’ TAA CTT CAC CAT CAG CCC CCA AAG C 3’ dan untuk reverse menggunakan OH-R 5’ TAT GGG CCC GGA GCG AGG AGA
GTA G 3’ dengan target pada 489 bp.
14 Adapun primer sexing yang digunakan adalah untuk Forward SRY_F 5’AGT
GAA GCG ACC CAT GAA CG 3’ sedangkan untuk Reverse adalah SRY_R 5’ TGT GCC TCC TGG AAG AAT GG 3’ dengan target pada 168 bp.
Amplifikasi DNA pada penelitian ini menggunakan mesin GeneAmpRPCR system 2400 Perkin Elmer. Kondisi PCR dilakukan sebagai berikut: tahap
pertama pra-PCR denaturasi awal pada suhu 94
o
C selama 10 menit, kemudian tahap kedua sebanyak 35 siklus dimulai dari denaturasi pada suhu 94
o
C selama 45 detik, selanjutnya pada suhu 60
o
C selama 90 detik untuk penempelan primer annealing, kemudian 72
o
C selama 60 detik untuk untuk perpanjangan elongation dan diakhiri dengan post PCR berupa extention pada suhu 72
o
C selama 7 menit dan penyimpanan pada suhu 20
o
C selama 10 menit.
3 Sequencing
Produk PCR hasil amplifikasi dimurnikan dengan menggunakan DNA purification kit
Qiagen, selanjutnya konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan Spektrofotometer Bio-Spectro Shimazu, setelah itu dilakukan cycle
sequencing dengan melakukan reaksi PCR dengan menggunakan primer orangutan dengan reagent khusus untuk DNA sequencing DIG Dye dari ABI. Kemudian
hasil cycle sequencing dipurifikasi. Setelah itu dilakukan perunutan DNA dengan menggunakan alat perunut otomatis ABI Prism versi 3100-Avant Genetic Analyzer
USA. Hasil sequencing selanjutnya dianalisis dengan menggunakan software Mega4 Tamura et al. 2007.
Dari data yang diperoleh diketahui bahwa seluruh orangutan merupakan hewan peliharaan masyarakat dari beberapa daerah yang berbeda, dan tidak
diketahui asal mereka ditangkap sebelumnya, sehingga tidak diketahui masuk kedalam anak jenis yang mana orangutan yang di pusat rehabilitasi tersebut.
Beberapa lokasi terletak di bagian utara dari sungai Kapuas seperti Singkawang, Toho dan Nanga Pinoh, yang lainnya terletak di selatan sungai Kapuas yaitu
Tempunak, akan tetapi tempat yang lainnya dipotong oleh sungai Kapuas seperti Putussibau, Penai dan Ngabang Landak sehingga sulit untuk mengetahui masuk
kedalam anak jenis yang mana orangutan yang dipelihara tersebut.
2.6 Analisis Spasial
