Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Juli 2008 di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta untuk pembuatan inokulum bakteri dan fungi dan penanaman dilakukan di rumah kaca Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan dan Alat Pembuatan Inokulum Bakteri dan Fungi Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat bakteri PH3-1B Paku Haji pada titik sampel ke 3, bakteri pertama, PH5-2B, PH4-3B dan isolat fungi PH1- 4F, PH1-3F, PH5-5F yang diisolasi dari sampel tanah Paku Haji, media NB Nutrient Broth, media NA Nutrient Agar, umbi kentang, dextrose, Bacto agar, kain kassa, akuades steril, spirtus dan alkohol 70. Alat-alat yang digunakan adalah gelas kimia, timbangan Schout Pro Ohaus 2000 gram, penangas air, stirrer, spatula, labu Erlenmeyer, stopwatch, gelas ukur, shaker , hemasitometer, mikroskop cahaya, counter, spektrofotometer, sentrifuge, vortex, dan autoklaf. Bahan dan Alat Inokulasi dan Penanaman Kedelai Bahan-bahan yang digunakan adalah inokulum bakteri PH3-1B, PH5-2B, PH4-3B dan inokulum fungi PH1-4F, PH1-3F, PH5-5F, larutan sagu 2, spirtus, alkohol 70, akuades steril, benih kedelai varietas Wilis, tanaman kedelai berumur 2 minggu, pasir dan tanah Paku Haji steril, pupuk N, pupuk P dan pupuk K dengan perbandingan 1:2:1. Alat-alat yang digunakan untuk penanaman kedelai adalah pot plastik dengan diameter 17 cm, bunsen, spatula, pinset, benang dan meteran. Alat-alat yang digunakan untuk pengukuran parameter fisik adalah lux meter, soil tester dan termometer. 3.3. Cara Kerja 3.3.1. Pembuatan Inokulum Isolat Bakteri dan Fungi Pembuatan Media NB dan NA Sebanyak 4 gram media NB ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, kemudian dilarutkan dalam 500 ml akuades steril. Media tersebut dipanaskan dengan menggunakan penangas air sampai homogen. Setelah itu, media disterilisasi dengan mengunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Hal yang sama dilakukan untuk pembuatan NA dengan penambahan agar sebanyak 7,5 gram. Pembuatan Media PDB dan PDA Kentang dikupas bersih, dipotong kecil-kecil dan ditimbang sebanyak 150 gram. Setelah itu, kentang dimasukkan ke dalam gelas kimia dan ditambahkan 300 ml akuades steril kemudian dipanaskan dengan menggunakan penangas air. Selanjutnya, dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain kassa steril 4 lapis dan ditambahkan akuades steril sampai volumenya mencapai 500 ml, kemudian ditambahkan dextrose sebanyak 7,5 gram. Media tersebut dipanaskan kembali sampai homogen kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Hal yang sama dilakukan untuk pembuatan PDA dengan penambahan agar sebanyak 7,5 gram. Peremajaan Stok Bakteri dan Fungi Pelarut Fosfat Isolat bakteri dari kultur stok PH3-1B diambil sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan ke dalam media NA miring. Hal yang sama dilakukan pada isolat bakteri PH5-2B dan PH4-3B kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam. Isolat fungi dari kultur stok PH1-4F diambil sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan ke dalam media PDA miring. Hal yang sama dilakukan pada isolat fungi PH1-3F dan PH5-5F kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Pengamatan Morfologi dan Pengukuran Panjang Sel Bakteri Isolat bakteri yang digunakan, yaitu PH3-1B, PH4-3B dan PH5-2B, dijadikan preparat kering dan dilakukan pewarnaan Gram. Dengan menggunakan pewarnaan Gram tersebut dapat dilihat kemurnian isolat bakteri. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara berikut ini, satu tetes NaCl fisiologis diteteskan di atas kaca objek, ditambahkan satu ose kultur PH3-1B, dicampur sampai homogen, dikeringkan dan difiksasi di atas bunsen. Preparat kering ditambahkan larutan kristal violet dan didiamkan selama satu menit, kemudian dibilas dengan menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu, preparat ditambahkan larutan iodin, didiamkan selama satu menit, kemudian dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat diteteskan alkohol 95 selama beberapa detik kemudian dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat kemudian ditambahkan safranin, didiamkan selama 45 detik, lalu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat tersebut diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x kemudian difoto. Berrdasarkan hasil foto, diambil 5 sel secara acak dari masing-masing isolat kemudian diukur dengan menggunakan penggaris. Setelah itu, rata-rata pengukuran panjang tersebut dikonversi berdasarkan ukuran bakteri yang tertulis pada gambar. Pembuatan Kurva Standar Isolat Bakteri Kultur stok isolat bakteri PH3-1B yang telah diremajakan dibuat menjadi suspensi bakteri yang diencerkan beberapa kali. Setiap suspensi dengan pengenceran yang berbeda diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer λ 600 nm. Setelah itu, suspensi dengan absorbansi yang berbeda tersebut diukur jumlah selnya melalui metode Total Plate Count TPC pada media NA. Nilai-nilai absorbansi dan TPC yang diperoleh dibuat menjadi kurva standar dengan menggunakan Software Excel sehingga dapat diketahui jumlah sel pada suatu nilai absorbansi. Hal yang sama dilakukan untuk isolat bakteri PH4-3B dan PH5-2B. Pembuatan Kurva Tumbuh Bakteri Kultur isolat bakteri yang telah diremajakan diinokulasi seujung ose ke dalam 100 ml NB dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Kultur tersebut kemudian dikocok dengan menggunakan shaker 125 rpm sampai tercapai puncak pertumbuhan. Pada setiap interval 2 jam, sampel kultur diambil untuk diukur absorbansi, yang kemudian dikonversi menjadi jumlah selml. Hasil pengukuran tersebut dibuat menjadi kurva tumbuh sehingga dapat diketahui kapan terjadinya kecepatan pertumbuhan tertinggi. Pembuatan Inokulum Bakteri Kultur isolat bakteri yang telah diremajakan diinokulasi seujung ose ke dalam 100 ml NB dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Kultur tersebut kemudian dikocok dengan menggunakan shaker 125 rpm sampai tercapai fase aktif pertumbuhan. Setelah itu, kultur disentrifuge selama 10 menit 3000 rpm. Supernatan hasil sentrifuge dibuang kemudian pelet diencerkan dengan penambahan NaCl fisiologis sampai absorbansi tertentu λ 700 nm untuk mencapai jumlah sel 10 9 cfuml. Pembuatan Inokulum Isolat Fungi Spora yang terbentuk dari hasil peremajaan yang berumur 7 hari ditambahkan 20 ml akuades steril, kemudian spora diluruhkan dengan menggunakan ose sehingga diperoleh suspensi spora. Kemudian dihitung jumlah sporanya dengan menggunakan kamar hitung Neubaeur pada mikroskop cahaya perbesaran 400 X. Suspensi spora yang diinginkan adalah dengan konsentrasi 5x10 9 sporaml PDB. Rumus jumlah sporaml : Rata-rata jumlah spora : Dimana : 0,1 mm : Kedalaman kamar hitung 0,0025 mm 2 : Luas kamar hitung R1 : Spora ruang 1 R2 : Spora ruang 2 R3 : Spora ruang 3

3.3.2. Inokulasi Benih dan Akar Inokulasi Benih

Benih yang digunakan dalam penelitian ini memiliki karakter yang sama yaitu berukuran besar, tidak cacat dan berwarna seragam. Benih kedelai yang akan ditanam dilukai dengan menggunakan jarum steril dan dimasukkan ke dalam alkohol 70 selama 1 menit kemudian direndam di dalam larutan sagu 2 selama 2 menit. Setelah itu, benih direndam ke dalam suspensi isolat bakteri pelarut fosfat dengan kepadatan 5x10 9 cfuml selama 5 menit. Perlakuan yang diuji terdiri atas 6 macam, yaitu perendaman benih dalam suspensi bakteri PH3-1B, PH4-3B dan PH5-2B dan fungi PH1-3F, PH1-4F dan PH5-5F. Kontrol yang digunakan Rata-rata jumlah spora X faktor pengenceran 0,1 X 0,0025 mm 2 R1 + R2 + R3 3 adalah akuades steril kontrol 1 dan larutan sagu 2 kontrol 2. Benih kedelai tersebut siap untuk ditanam. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali Fitriatin dan Simarmata, 2005. Inokulasi Akar Akar tanaman kedelai yang telah memiliki 2-3 daun utama diambil kemudian dibersihkan dari media tanam campuran pasir dan tanah Paku Haji dengan menggunakan air mengalir dan dilakukan perendaman dengan menggunakan alkohol 70 selama 1 menit. Setelah itu, akar tersebut dilukai dengan menggunakan jarum steril kemudian dimasukkan ke dalam larutan sagu 2 selama 30 detik dan direndam dalam suspensi isolat mikroba bakteri dan fungi pelarut fosfat dengan kepadatan 5x10 9 cfuml selama 60 detik. Kontrol yang digunakan adalah akuades steril kontrol 1 dan larutan sagu 2 kontrol 2. Akar tanaman kedelai tersebut siap untuk ditanam kembali. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali Montealegre et al, 2003.

3.3.3. Penanaman Kedelai Persiapan Media Tanam

Pasir diayak dengan menggunakan ayakan berdiameter 3 mm. Hal yang sama dilakukan untuk tanah. Setelah itu, pasir dan tanah dimasukkan ke dalam plastik tahan panas dengan perbandingan 3:1 sebanyak 1 kg, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf. Campuran pasir dan tanah tersebut dimasukkan ke dalam pot plastik yang berdiameter 17 cm kemudian diberikan campuran pupuk NPK dengan perbandingan 1:2:1 sebanyak 1 gram. Penanaman, Pemupukan dan Pemeliharaan Tiga benih kedelai ditanam dalam media tanam dengan kedalaman 2 cm pada pot plastik dan ditempatkan di dalam rumah kaca. Pemeliharaan tanaman kedelai dilakukan dengan penyiraman setiap hari. Pembersihan gulma di sekitar tanaman dilakukan dengan cara pencabutan sedangkan pemeliharaan dari hama dan penyakit tanaman dilakukan dengan penyemprotan fungisida Dithane M-45 dengan dosis 1,5 gram per liter. Pengamatan Parameter Tanaman dan Lingkungan Parameter yang diamati adalah: A. Perkecambahan, dilakukan dengan mengamati waktu benih berkecambah dan muncul ke permukaan media tanam. Hanya satu tanaman dari setiap pot yang terus diamati sampai akhir pengamatan. B. Tinggi tanaman, dilakukan dengan mengukur tinggi tanaman dari permukaan tanah sampai ujung tanaman tertinggi dengan menggunakan benang. Selanjutnya, benang tersebut diukur dengan menggunakan meteran. C. Jumlah daun, dilakukan dengan menghitung jumlah daun yang tumbuh. D. Lebar daun, dilakukan dengan menggunakan benang pada permukaan daun. Selanjutnya, benang tersebut diukur dengan menggunakan meteran. E. Berat kering tanaman, dilakukan dengan mencabut akar kemudian dibersihkan dari media tanam dengan menggunakan air mengalir kemudian tanaman kedelai ditimbang berat basah. Setelah itu, tanaman kedelai tersebut dikeringkan dengan menggunakan oven kemudian ditimbang kembali berat kering. Selanjutnya dihitung selisih berat kering dan berat basah. Pengamatan parameter tinggi tanaman, jumlah dan lebar daun dilakukan setiap 2 hari sedangkan untuk berat kering tanaman dilakukan di akhir pengamatan. Pengamatan parameter lingkungan yang dilakukan adalah pengukuran suhu rumah kaca dengan menggunakan termometer, kelembaban dan pH media tanam dengan menggunakan soil tester, dan intensitas cahaya dengan menggunakan lux meter.

3.3. Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini yang merupakan pengamatan ketiga parameter tinggi tanaman, jumlah dan lebar daun diolah secara statistik dengan metode analisis variansi satu arah one way Anova dengan rancang acak lengkap pada taraf uji 0,05. Hipotesis : parameter pada kontrol dan perlakuan tidak berbeda nyata Hipotesis 1 : parameter pada kontrol dan perlakuan berbeda nyata Jika signifikansi 0,05 maka H ditolak sedangkan jika signifikansi 0,05 maka H diterima. Apabila H ditolak maka dilanjutkan uji Duncan. Baik pada inokulasi akar maupun benih, faktor yang diuji adalah pengaruh pemberian isolat mikroba pelarut fosfat terhadap pertumbuhan tanaman kedelai varietas Wilis. Perbandingan pertumbuhan tanaman kedelai yang diinokulasi mikroba pelarut fosfat pada akar dilakukan secara deskriptif.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Morfologi Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dengan Pewarnaan Gram

Pengamatan morfologi isolat bakteri pelarut fosfat yang telah diberi pewarnaan Gram bertujuan untuk memastikan tidak terjadinya kontaminasi pada kultur yang digunakan. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa semua isolat bakteri pelarut fosfat yang diamati PH3-1B, PH4-3B dan PH5-2B merupakan bakteri Gram positif Gambar 1, 2 dan 3. Secara mikroskopis, semua isolat bakteri pelarut fosfat yang diuji menunjukkan berbentuk batang dan pada setiap preparat sel-selnya tampak seragam. Menurut Pelczar dan Chan 1986, salah satu bakteri yang menunjukkan ciri berbentuk batang dan Gram positif adalah Bacillus sp. Beberapa jenis Bacillus sp. memiliki kemampuan melarutkan fosfat seperti Bacillus megaterium dan Bacillus subtilis Motsara et al, 1995. Meskipun semua berbentuk batang, ketiga isolat bakteri memiliki panjang yang berbeda. Rata-rata ukuran panjang PH3-1B 1,68 m terlihat lebih besar dibandingkan kedua isolat lainnya, yaitu PH5-2B 1,08 m dan PH4-3B 0,36 m. Dengan karakter bakteri yang menunjukkan Gram positif, maka bakteri tersebut tahan terhadap pengaruh faktor lingkungan yang ada di tanah masam. Menurut Pelczar dan Chan 1986, bakteri Gram positif lebih resisten terhadap gangguan fisik dan perlakuan mekanis. Dinding sel bakteri Gram positif memiliki peptidoglikan yang lebih tebal Pelczar dan Chan, 1986, sehingga dapat bertahan hidup pada tanah di daerah Paku Haji yang bersifat masam