BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup Institut Pertanian Bogor PPLH IPB dari bulan
Maret hingga Juli 2011.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam persiapan media yaitu meliputi timbangan analitik, gelas ukur, pipet, labu erlenmeyer, labu takar, gelas piala,
pengaduk, botol kultur dan autoclave. Sedangkan untuk kegiatan penanaman alat- alat yang digunakan antara lain laminar air flowcabinet, handsprayer, lampu
bunsen, pinset, pisau, scalpel, tissue, dan cawan petri. Bahan-bahan yang diperlukan dalam pembuatan media antara lain agar-
agar, gula pasir, air steril, larutan stok media MS, BAP, propolis, dan PPM. Sedangkan untuk kegiatan sterilisasi dan penanaman bahan-bahan yang digunakan
yaitu deterjen, fungisida dan bakterisida, clorox, HgCl
2
, betadine, air steril, alkohol dan eksplan Pulai Alstonia scholaris L. R. Br bagian titik tumbuh.
Bahan eksplan pulai merupakan jenis pulai darat yang berasal dari PT. Xylo Indah Pratama yang didatangkan dari pulau Sumatra.
3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Sterilisasi alat dan media Kultur
Alat-alat yang akan digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pipet, pengaduk, gelas piala, labu takar dicuci
bersih menggunakan detergen. Kemudian, alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus alat-alat tersebut menggunakan
kertas tebal dan selanjutnya semua alat-alat tersebut diautoclave pada suhu 121 ⁰C
-126 ⁰C dan tekanan 1,5 atm selama 60 menit. Sedangkan untuk media yang telah
dimasukan ke dalam botol kultur lalu dimasukan ke dalam autoclave pada suhu 121
⁰C -126⁰C dan tekanan 1,5 atm selama 20 menit.
3.3.2 Sterilisasi lingkungan kerja
Pembersihan laboratorium dilakukan setiap hari terutama untuk penyeleksian botol kultur yang terkontaminasi. Pengepelan dan penyemprotan rak
kultur dengan alkohol juga dilakukan secara berkala. Pembersihan tempat kerja laminar air flow cabinet dapat dilakukan dengan mengelap permukaan atau
meja kerja menggunakan kapas atau tisu yang telah disemprot alkohol 70. Lalu, sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam laminar air flow
cabinet harus dinyalakan untuk menghindari adanya kontaminan yang masuk ke dalam botol kultur ketika penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan
maka dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70 terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman.
3.3.3 Sterilisasi bahan tumbuhan indukan
Proses dan tahapan karantina bahan indukan meliputi : 1. Penyemprotan dengan fungisida dan bakterisida atau antibiotika setiap sore
secara bergiliran. -
Fungisida Antracol 1 gl dan Bakterisida Agrept 1 gl dicampur dan dilarutkan
- Antibiotika Amoxiciline 200 mll
2. Penyemprotan dengan hormon tunas atau Hyponex hijau + GA setiap pagi secara bergiliran
- Hormon tunas 10 mll
- Hyponex Hijau 2 gl + GA 100 mll
3. Penggunaan Dekastar N Tinggi pada media tanam 4. Penyemprotan dengan insektisida
3.3.4 Sterilisasi bahan eksplan
Pulai yang sudah dikarantina dan akan diambil sebagai eksplan diberi perlakuan sterilisasi yang meliputi sterilisasi eksplan di luar laminar air flow
cabinet dan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow cabinet. Adapun tahapan sterilisasi eksplan di luar lamiar air flow cabinet meliputi :
1. Pemotongan eksplan dari bahan indukan
2. Pengolesan dengan alkohol 70 3. Pencucian dengan air
4. Pencucian dengan detergen 10 menit 5. Pencucian menggunakan air hingga bersih
Sedangkan tahapan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow cabinet meliputi :
1. Pencucian menggunakan air steril selama ± 5 menit 2. Perendaman dengan HgCl
2
0,01 mg100 ml selama 7-10 menit 3. Perendaman menggunakan clorox 5 selama ± 3 menit
4. Perendaman dengan larutan betadine 0,5 ml100 ml selama 7-10 menit 5. Pembilasan dengan air steril sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit.
3.3.5 Pembuatan media 3.3.5.1 Pembuatan larutan stok
Pembuatan larutan stok dilakukan secara terpisah sesuai dengan pengelompokannya yaitu larutan stok makro, stok mikro, stok Fe-EDTA, stok
vitamin dan stok hormon BAP.Adapun rincian komposisinya yaitu larutan stok makro terdiri dari KNO
3
, NH
4
NO
3,
CaCl
2.
2H
2
O, MgSO
4.
7H
2
O dan KH
2
PO
4
masing-masing dibuat secara terpisah. Larutan Stok mikro terdiri dari campuran MnSO
4.
H
2
O, ZnSO
4.
7H
2
O, H
3
BO
3,
KI, Na
2
MoO
4
. 2H
2
O, CoCl.6H
2
O, 4CuSO
4.
5H
2
O. Larutan Stok Fe-EDTA terdiri dari campuran senyawa C
10
H
14
N
2
Na
2
O
8
2H
2
O Na-EDTA dan FeSO
4.
7H
2
O. Larutan stok vitamin terdiri dari Thiamin HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin HCl, dan Glycin. Larutan stok
hormon BAP. Unsur hara yang telah ditimbang beratnya sesuai dengan yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dengan 1 liter aquades. Setelah larutan stok
selesai dibuat selanjutnya disimpan di lemari es.
3.3.5.2 Pembuatan media Murashige Skoog MS dengan larutan BAP
Pembuatan media dimulai dengan pembuatan larutan stock MS dan hormon BAP yang telah dipersiapkan sebelumnya. Untuk pelaksananaan
pembuatan media yaitu sebagai berikut : 1. Menyiapkan 200 ml air aquadest dalam gelas piala
2. Memipet dan memasukan larutan A, B, C, D, E, F, myo inositol masing- masing 5 ml, vitamin 2 ml, dan hormon BAP sebanyak 1,5 ml.
3. Memasukan 30 gram gula pasir 4. Menambahkan air aquadest hingga volume menjadi tepat 1000 ml
5. Mengukur pH larutan yaitu antara 5-6, jika terlalu asam tambahkan NAOH dan jika terlalu basa tambahkan HCl
6. Memasukan 6 gram agar-agar kedalam larutan tersebut 7. Memasak larutan media dalam panci hingga mendidih
8. Menuangkan media kedalam botol kultur ±10 ml 9. Menutup botol dengan plastik dan karet
10. Mensterilisasikan media didalam autoclave pada suhu 121 ⁰C-126⁰C dan
tekanan 1,5 atm selama 20 menit. 11. Memasukan media-media yang sudah steril kedalam plastik dan simpan di
lemari
3.3.5.3 Pembuatan media perlakuan
Pembuatan media perlakuan diawali dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol MS0+BAP1,5. Akan tetapi untuk media perlakuan pada
larutan MS0+BAP1,5 ditambahkan antibiotika berupa PPM danatau propolis sesuai dengan perlakuan yakni sebesar 0 mll, 0,5 mll, 1mll, 1,5 mll dan 2 mll.
Penambahan antibiotika ini PPM danatau propolis dilakukan sebelum larutan MS0+BAP1,5 diencerkan dengan air aquades hingga volume akhir 1 liter terdapat
pada media yang sudah lengkap. Setelah larutan media perlakuan selesai dibuat, larutan tersebut lalu diukur
dengan menggunakan pH meter. Pada umumnya pH media yang digunakan yakni 5,6-5,8, bila larutan Ph5,8 maka dilakukan penambahan HCL dan jika pH 5,6
maka dilakukan penambahan NAOH. Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 6 grl dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu
larutan dituang kedalam botol-botol kultur sebanyak 10 ml. Lalu botol ditutup dengan rapat dan beri label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi
media tersebut dalam autoclave pada suhu 121 ⁰C-126⁰C dengan 1,5 atm selama
20 menit.
3.3.6 Penanaman
Penanaman eksplan pulai dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setelah dilakukan sterilisasi pada eksplan kemudian eksplan dimasukan ke dalam
petridish dan potong bagian tumbuhan yang terkena bahan sterilan lalu tanam dalam media kultur, setelah selesai penanaman botol kultur diletakan dalam ruang
kultur.
3.4 Pengamatan
Pengamatan dilakukan selama kurang lebih 8 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. Hal yang diamati yaitu :
- Jumlah eksplan yang hidup ditandai dengan jumlah eksplan yang berwarna
kehijauan. -
Jumlah eksplan yang mati ditandai dengan jumlah eksplan yang mengalami browning pencoklatan atau berwarna merah dan tidak muncul tunas.
- Jumlah eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan adanya jamur
cendawan dan bakteri. Selain itu, untuk mengetahui pengaruh pemberian antibiotika pada
pertumbuhan eksplan pulai maka dilakukan pengamatan terhadap : -
Jumlah tunas yang tumbuh -
Pertambahan tinggi tunas -
Jumlah daun yang tumbuh
3.5 Rancangan Percobaan
Percobaan ini dilakukan pada tahap inisiasi dengan jenis eksplan pucuk. Adapun rancangan percobaan ini dirancang dengan menggunakan percobaan
faktorial dua faktor dengan dasar rancangan acak lengkap RAL. Faktor pertama adalah jenis antibiotika yang terdiri dari : Plant preservative mixture PPM dan
Propolis. Faktor yang kedua yakni konsentrasi yang terdiri dari lima taraf yaitu 0mll, 0,5 mll, 1 mll, 1,5 mll, dan 2 mll. Dengan demikian terdapat 5
2
= 25 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan sehingga seluruhnya
terdapat 250 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari satu botol
yang berisi satu eksplan. Berikut merupakan gambaran interaksi antar faktor dari percobaan yang dilaksanakan :
Tabel 4. Interaksi faktor jenis antibiotika dengan konsentrasinya
PPM mll A
Propolis mll B 0 B0
0,5 B1 1 B2
1,5 B3 2 B4
0 A0 A0B0
A0B1 A0B2
A0B3 A0B4
0,5 A1 A1B0
A1B1 A1B2
A1B3 A1B4
1 A2 A2B0
A2B1 A2B2
A2B3 A2B4
1,5 A3 A3B0
A3B1 A3B2
A3B3 A3B4
2 A4 A4B0
A4B1 A4B2
A4B3 A4B4
Keterangan : A0B0 = Kontrol
3.6 Analisis Data
Kategori