TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Identitas Ekstrak

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari hingga bulan Juli 2014 di Laboratorium Bahan Alam, Pusat Penelitian Kimia –Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, serpong.

3.2 BAHAN DAN ALAT

3.2.1 Bahan Uji Bahan uji yang digunakan adalah bagian daun dari tanaman Salam

Syzygium polyanthum yang diperoleh dari tiga daerah tempat tumbuh yaitu : Ogan Komering Ulu OKU Timur Desa Nusa Tunggal Kec. Belitang III Kab. OKU Timur Provinsi Sumatera Selatan sebanyak 1.613,6 gram, Sukoharjo Tegalmiri RT 0205, Puhgogor, Bendosari, Sukoharjo sebanyak 1.893,3 gram, dan Tangerang Selatan kawasan Puspiptek, jalan Raya Puspiptek Serpong, Tangerang Selatan, Banten sebanyak 3.158,8 gram.

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah : etanol 70 , kloroform LP, aquadest, etanol 95 , metanol, n-heksan, etil asetat, H 2 SO 4 2 N, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendorf, serbuk Mg, HCl pekat, FeCl 3 1 , NaOH 1 N, eter, pereaksi Lieberman-Buchard, HCl 4 N, AlCl 3 10, Na asetat 1 M, kuersetin sigma, HNO 3 pekat, HNO 3 pekat, dan HClO 4 .

3.2.3 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik mettler toledo AB 204-sFOC, labu erlenmeyer, cawan penguap, kertas saring, tabung reaksi, pipet tetes, oven, piknometer, labu ukur, plat KLT, hot plate, desikator, gelas kimia, gelas ukur, corong, spatula, batang pengaduk, mikropipet, kertas saring, kertas saring bebas abu, botol timbang, krus silikat, waterbath, magnetic stirrer, Pilot plant Buchi glassuster, Rotary evaporator Buchi, oven XMT-152A, plat KLT, Furnace Sibata SMS-160, Atomic Absorpsion 37 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Spectrophotometer AAS AA Shimadzu-6300, Spectrophotometer UV-Vis Mecasys, High Performance Liquid Chromatography HPLC Shimadzu- 10AVP, dan Gas Chromatography-Mass Spectrometry GCMS Shimadzu- QP2010.

3.3 PROSEDUR KERJA

3.3.1 Pengambilan Sampel

Sampel daun salam yang digunakan diperoleh dari tiga daerah yang berbeda yaitu Ogan Komering Ulu OKU Timur Desa Nusa Tunggal Kec. Belitang III Kab. OKU Timur Provinsi Sumatera Selatan, Sukoharjo Tegalmiri RT 0205, Puhgogor, Bendosari, Sukoharjo, dan Tangerang Selatan kawasan Puspiptek, jalan Raya Puspiptek Serpong Tangerang Selatan, Banten. Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari. Sampel yang diambil dalam keadaan masih segar.

3.3.2 Determinasi Sampel

Determinasi sampel daun salam Syzygium polyanthum Wight dari ketiga tempat tumbuh dilakukan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi- LIPI, Bogor, Jawa Barat.

3.3.3 Penyiapan Simplisia

Simplisia yang telah didapat kemudian dipisahkan berdasarkan lokasi pengambilan agar masing-masing simplisia tidak tercampur. Penyiapan simplisia daun salam dilakukan dengan cara sortasi basah untuk memisahkan kotoran atau bahan-bahan asing lainnya pada daun. Kemudian dilakukan pencucian dengan air mengalir untuk menghilangkan tanah dan pengotor lainnya yang masih menempel pada bahan yang sudah disortasi basah. Tahap selanjutnya adalah proses pengeringan dengan cara dikering anginkan dan dilakukan sortasi kering. Kemudian simplisia yang sudah benar-benar kering dilakukan penggilingan untuk mendapatkan serbuk simplisia. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.4. Pengamatan Makroskopik

Pengamatan makroskopik meliputi uji fisik terhadap daun salam Syzygium Polyanthum yang digunakan seperti bentuk daun, bau, rasa, dan warna daun.

3.3.5 Pembuatan Ekstrak

Masing-masing simplisia dimaserasi dengan cara mencampurkan ±1kg simplisia kering daun salam yang sudah dibuat serbuk dengan etanol 70. Proses maserasi dilakukan sampai hasil maserat mendekati tidak berwarna dan dilakukan penyaringan setiap 24 jam. Maserat dikumpulkan lalu dikentalkan dengan menggunakan rotary evaporator. Kemudian dihitung rendemen dari ekstrak kental tersebut. 3.3.6 Penentuan Parameter-Parameter Standardisasi 3.3.6.1 Parameter spesifik

a. Identitas Ekstrak

Deskripsi tata nama meliputi : nama ekstrak, nama latin tumbuhan, bagian tumbuhan yang digunakan, dan nama Indonesia tumbuhan Anonim, 2000. b. Organoleptik Ekstrak Penentuan organoleptik ekstrak dilakukan dengan menggunakan pancaindra untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa. Tujuannya untuk pengenalan awal yang sederhana seobyektif mungkin Anonim, 2000. c. Penentuan kadar senyawa terlarut dalam pelarut tertentu Anonim, 2000 Penentuan kadar senyawa terlarut dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak dengan pelarut alkohol atau air untuk ditentukan jumlah solut yang identik dengan jumlah senyawa kandungan secara gravimetri. Dalam hal tertentu dapat diukur senyawa terlarut dalam pelarut lain misalnya n-heksan, diklorometan, metanol. Tujuannya untuk memberikan gambaran awal jumlah senyawa kandungan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 1. Kadar senyawa yang larut dalam air Sejumlah 1,0 g ekstrak dimasukkan ke dalam labu bersumbat dan ditambahkan 25,0 mL air-kloroform LP 2,5 mL kloroform dimasukkan dalam labu ukur 1000 mL dan ditambahkan air hingga tanda batas. Kemudian didiamkan selama 24 jam sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sebanyak 5,0 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Lalu residu dipanaskan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Kadar dalam persen senyawa yang larut air dihitung terhadap ekstrak awal Saifudin, Rahayu, Teruna, 2011. Keterangan : A 1 = Bobot cawan + Residu setelah pemanasan g A = Bobot cawan kosong g B = Bobot sampel awal g 2. Kadar senyawa larut dalam etanol Sejumlah 1,0 g ekstrak dimasukkan ke dalam labu bersumbat dan ditambahkan 25,0 mL etanol 96. Kemudian didiamkan selama 24 jam sambil dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam. Lalu disaring dengan cepat untuk menghindarkan penguapan etanol. Sebanyak 5,0 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Residu dipanaskan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Kadar dalam persen senyawa yang larut etanol 95 dihitung terhadap ekstrak awal Keterangan : A 1 = Bobot cawan + Residu setelah pemanasan g A = Bobot cawan kosong g B = Bobot sampel awal g UIN Syarif Hidayatullah Jakarta d. Identifikasi kandungan kimia ekstrak 1. Penapisan golongan kimia ekstrak a Uji terpenoid dan steroid Ekstrak sebanyak 0,5 g dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL kloroform dan disaring. Filtrat ditambahkan beberapa tetes asam sulfat dan dikocok. Terbentuknya warna kuning emas mengindikasi positif terpenoid tes salkowski. Sedangkan untuk steroid, setelah filtrat disaring dan ditambahkan asam sulfat maka akan terbentuk cincin berwarna coklat Lieberman-burchard Tiwari, et al, 2011. b Uji flavonoid Ekstrak sebanyak 1 g ditambahkan serbuk Mg, lalu ditambahkan HCl pekat. Apabila terbentuk warna orange, merah, atau kuning, berarti positif flavonoid Arifin, Anggraini, Handayani, Rasyid, 2006 c Uji tanin Sejumlah 1 g ekstrak ditambahkan 10 mL air dididihkan selama 15 menit. Filtratnya disaring dan direaksikan dengan FeCl 3 1 . Tanin positif apabila terbentuk warna biru tua atau hitam kehijauan Mutiatikum, Alegantina, Astuti, 2010. d Uji saponin Sebanyak 0,5 gram serbuk dimasukkan dalam tabung pereaksi ditambahkan 10 mL air panas dan didinginkan. Kemudian dikocok dengan kuat selama 10 detik sehingga terbentuk buih yang mantap selama 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm, dengan penambahan 1 tetes HCl 2 N buih tidak hilang Mutiatikum, Alegantina, Astuti, 2010. e uji alkaloid Sebanyak 5 gram serbuk ditambahkan 10 mL HCl 0,1 N lalu dimaserasi selama 2 jam dan disaring. Kemudian sebanyak 1 mL filtrat ditambahkan 5 tetes pereaksi dragendorf sehingga terjadi endapan coklat kemerahan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Untuk memperjelas, sebanyak 1 mL filtrat ditambahkan 5 tetes pereaksi meyer terbentuk endapan putih Mutiatikum, Alegantina, Astuti, 2010. 2. Pola kromatogram Pada pengujian pola kromatogram ini menggunakan Kromatografi Lapis Tipis. Prosedurnya yaitu dengan cara melarutkan sebanyak 5 mg ekstrak dari ketiga sampel masing-masing dalam 1 mL metanol. Masing-masing larutan uji kemudian ditotolkan pada plat KLT yang berupa silika gel sebagai fase diam, lalu dielusi dengan fase gerak yang sesuai. Kemudian diamati pemisahan senyawa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Untuk menampakkan bercak pada plat KLT, disemprotkan H 2 SO 4 pada plat KLT Saifudin, Rahayu, Teruna, 2011. Pada pengujian pola kromatogram menggunakan High Performance Liquid Chromatography HPLC, dilakukan dengan berbagai kombinasi fase gerak air, metanol, dan asetonitril. 3. Penentuan Kadar Flavonoid Total a. Pembuatan Standar Sebanyak 10 mg Quersetin dilarutkan dalam etanol 80 dan dilarutkan menjadi 5, 10, 15, dan 20 μgmL. Larutan standar 0,5 mL pada masing-masing konsentrasi dicampurkan dengan 1,5 mL etanol 95 lalu ditambahkan 0,1 mL AlCl 3 10, 0,1 mL CH 3 COOK 1 M dan 2,8 mL aquadest. Larutan diinkubasikan dalam suhu kamar selama 30 menit lalu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 415 nm dan digunakan larutan tanpa Quersetin sebagai blanko. b. Pengukuran Sampel Sebanyak 0,1 gram ekstrak dilarutkan dalam 1 mL aquadest lalu 0,5 mL larutan sampel diambil dan dicampurkan dengan 1,5 mL alkohol 95 dan ditambahkan 0,1 mL AlCl 3 10, 0,1 mL CH 3 COOK 1 M, dan 2,8 mL aquadest lalu diinkubasikan dalam suhu kamar selama 30 menit. Absorbansi dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 415 nm dan aquadest tanpa ekstrak digunakan sebagai blanko standar. Data UIN Syarif Hidayatullah Jakarta diekspresikan dalam milligram Quersetin Equivalent QE100 gram. Pengujian ini dilakukan sebanyak 3 kali.

3.3.6.2 Parameter Non Spesifik

a. Parameter Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang sebanyak 1-2 g dan dimasukkan dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 o C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5-10 mm. Kemudian dimasukkan dalam ruang pengering dengan tutup botol dibuka. Dikeringkan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Lalu botol dalam keadaan tertutup dibiarkan mendingin dalam desikator hingga suhu kamar Anonim, 2000. Kemudian bobot yang diperoleh dicatat. Ket : A = Bobot sampel sebelum dipanaskan g B = Bobot sampel setelah dipanaskan g b. Parameter Bobot Jenis Pada penetapan bobot jenis ini digunakan ekstrak dengan pengenceran 5 . Penetapan bobot jenis menggunakan piknometer yang bersih dan kering serta telah dikalibrasi dengan menetapkan bobot piknometer dan bobot air yang baru dididihkan pada suhu 25 o C. Suhu ekstrak cair diatur hingga lebih kurang 20 o C, lalu dimasukkan dalam piknometer. Suhu piknometer yang telah diisi diatur hingga 25 o C, kelebihan ekstrak cair dibuang dan piknometer ditimbang. Bobot piknometer kosong dikurangkan dengan bobot piknometer yang telah diisi. Bobot jenis ekstrak cair adalah hasil yang diperoleh dengan membagi bobot ekstrak dengan bobot air, dalam piknometer pada suhu 25 o C Anonim, 2000. Bobot Jenis x BJ Air UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Ket : W0 = bobot piknometer kosong g W1 = bobot piknometer + air g W2 = bobot piknometer + ekstrak g BJ Air = bobot jenis air 1 c. Parameter Kadar Air Sebanyak 10 g ekstrak dimasukkan dalam wadah yang telah ditara. Kemudian dikeringkan pada suhu 105 o C selama 5 jam lalu ditimbang. Pengeringan dilanjutkan dan ditimbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25 Anonim, 2000. Ket : A = Bobot sampel sebelum dipanaskan g B = Bobot sampel setelah dipanaskan g d. Parameter Kadar Abu Lebih kurang 2-3 gr ekstrak digerus dan ditimbang dengan seksama, lalu dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, kemudian diratakan. Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, lalu didinginkan dan ditimbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas dan disaring melalui kertas saring bebas abu. Sisa kertas dan kertas saring dipijarkan dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan dalam krus, lalu diuapkan dan dipijarkan hingga bobot tetap. Kemudian ditimbang dan dihitung kadar abu terhadap berat sampel awal. Ket : A 1 = Bobot krus + ekstrak setelah pemijaran g A = Bobot krus kosong g B = Bobot sampel awal g UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Untuk pengukuran kadar abu tidak larut asam, abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dengan 25 ml asam sulfat encer P selama 5 menit, dikumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam disaring dengan kertas saring bebas abu yang sebelumnya telah ditimbang. Lalu dicuci dengan air panas dan dipijarkan hingga bobot tetap, kemudian ditimbang. Kemudian dihitung kadar abu tidak larut asam terhadap berat sampel awal. Ket : A 1 = Bobot krus + ekstrak setelah pemijaran g A = Bobot krus kosong g B = Bobot sampel awal g C = Bobot kertas saring bebas abu g 0,0076 = Bobot kertas saring bebas abu bila menjadi abu e. Penetapan Sisa Pelarut Penetapan sisa pelarut pada ekstrak menggunakan GCMS Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Larutan baku yang digunakan yaitu etanol mutlak. Larutan uji dibuat dengan menimbang ekstrak daun salam sebanyak 10 mg lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas pada labu ukur 100 mL. Larutan uji sebanyak 0,5 mL disuntikkan ke dalam kromatograf, lalu diamati perbandingan respon puncak antara larutan baku dan larutan uji dalam rekam kromatogram Anonim, 2000. f. Parameter Uji Cemaran Logam Berat 1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Pembuatan kurva baku diantaranya Pb, Cd, dan As. Larutan induk timbal Pb 1000 ppm, dibuat stok larutan standar 10 ppm dengan cara mengambil sebanyak 1 mL larutan induk 1000 ppm kemudian ditambahkan aquabidest hingga 100 mL. Kemudian dibuat larutan seri kadar Pb 0,05; 0,10; 0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50 ppm. Lalu diukur absorbansinya dari larutan standar diperoleh persamaan kurva baku y = a + bx dengan r mendekati 1. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Larutan induk Cd 1000 ppm dibuat stok larutan standar 1000 ppb dengan cara mengambil sebanyak 0,1 mL larutan induk 1000 ppm kemudian ditambahkan aquabidest hingga 100 mL. Kemudian dibuat seri kadar Cd 0,0005; 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 ppm. Lalu diukur absorbansinya dari larutan standar diperoleh persamaan kurva baku y = a + bx dengan r mendekati 1. Untuk kurva baku As dibuat dengan konsentrasi 0,5; 1,0; 5; 10; 50 ppb. Lalu diukur absorbansinya dari larutan standar diperoleh persamaan kurva baku y = a + bx dengan r mendekati 1. 2. Penetapan Kadar Logam Berat pada Ekstrak Penetapan kadar logam berat As, Pd, dan Cd dilakukan dengan cara digesti basah dengan menggunakan metode AAS. Sebanyak 1 gr ekstrak ditimbang dan ditambahkan 10 ml HNO 3 pekat, setelah itu dipanaskan dengan Heating mantel hingga kental atau kering. Setelah didinginkan, ekstrak ditambahkan aquabidest 10 ml dan asam perkolat 5 ml. Kemudian panaskan hingga kental dan disaring ke labu ukur 50 ml. Setelah itu ditambahkan aquabidest hingga 50 ml. Lalu sampel diukur dengan AAS, khusus arsen dengan tambahan alat HVG Hydride Vapor Generator. Saifudin, Rahayu, Teruna, 2011. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENELITIAN

4.1.1 Hasil Determinasi Sampel

Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Borgoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong, Bogor, Jawa Barat. Hasil determinasi menunjukkan bahwa sampel yang digunakan merupakan spesies Syzygium polyanthum Wight Walp.

4.1.2 Pengamatan Makroskopik Daun Salam

Pengamatan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati secara langsung kondisi fisik sampel daun salam yang digunakan. Dari hasil pengamatan didapatkan hasil sebagai berikut : Tabel 4.1 Pengamatan makroskopik daun Salam No Pengujian Tangerang Selatan Sukoharjo OKU Timur 1 Bentuk daun Helaian daun berbentuk lonjong sampai bulat telur, pangkal dan ujung meruncing, tepi rata, pertulangan menyirip, dan permukaan atas licin. Helaian daun berbentuk lonjong sampai bulat telur, pangkal dan ujung meruncing, tepi rata, pertulangan menyirip, dan permukaan atas licin. Helaian daun berbentuk lonjong sampai bulat telur, pangkal dan ujung meruncing, tepi rata, pertulangan menyirip, dan permukaan atas licin. 2 Bau Aromatik lemah. Aromatik lemah. Aromatik lemah. 3 Rasa Rasa khelat. Rasa khelat. Rasa khelat. 4 Warna daun Daun segar permukaan atas berwarna hijau tua dan permukaan bawah berwarna Daun segar permukaan atas berwarna hijau tua dan permukaan bawah berwarna Daun segar permukaan atas berwarna hijau tua dan permukaan bawah berwarna 47