12
3.3.2 Metode acuan ISO 7889:2003E
Pada metode ini terdapat dua prinsip pengujian jumlah bakteri kultur starter yogurt yaitu untuk Lactobacillus bulgaricus inkubasi dilakukan secara anaerob dengan media MRSA dan
Streptococcus thermophilus secara aerob dengan media M17. Pada penelitian ini hanya dilakukan validasi bakteri genus Lactobacillus sehingga pengujian akan dilakukan secara
anaerob dengan media MRSA. Sebanyak 1 mL dari tiga tingkat pengenceran tertinggi
dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Sebanyak 12 mL sampai dengan 15 mL media MRSA yang masih cair dengan
suhu 45 ± 1 °C dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri, kemudian semua cawan petri dimasukkan ke dalam suatu jar anaxomat dengan posisi terbalik. Jar anaerob yang telah
diperkaya dengan gas CO
2
kemudian diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 37 ± 1 °C selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan pencatatan pertumbuhan koloni pada setiap cawan petri
yang mengandung 15 koloni sampai dengan 300 koloni setelah 3 hari.
3.4 PROSEDUR VALIDASI METODE
3.4.1 Persiapan kultur uji konfirmasi kemurnian kultur uji
Kemurnian kultur stok acuan merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisis. Untuk memastikan kemurnian kultur stok acuan
diperlukan konfirmasi. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah Lactobacillus bulgaricus FNCC 004P. Kultur stok yang digunakan perlu diperbaharui agar aktivitasnya tidak
berkurang. Kultur stok dalam media MRSB yang yang disimpan terlalu lama dapat berkurang aktivitasnya karena habisnya substrat dan menumpuknya metabolit seperti asam.
Pemeliharaan kultur stok pada penelitian ini dilakukan dengan melakukan penusukan kultur pada media MRS agar semi solid, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Setelah itu kultur yang telah diinkubasi tersebut dapat disimpan dalam lemari pendingin
sebagai kultur stok dan dapat bertahan selama beberapa bulan. Kultur yang akan digunakan terlebih dahulu harus disegarkan dalam media selektif.
Sebanyak 1 ose dari kultur stok disegarkan ke dalam 10 mL MRSB, kemudian diinkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37
o
C. Kultur ini selanjutnya dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram. Dengan pewarnaan Gram ini akan dipastikan bahwa bakteri merupakan
bakteri Gram positif dan berbentuk batang.
3.4.2 Penghitungan jumlah bakteri asam laktat pada kultur uji
Penelitian ini diawali dengan penghitungan jumlah spike. Spike adalah inokulum sebagai kontrol positif yang telah diketahui dengan pasti jumlah kolonimL. Spike dibuat
dengan menggunakan biakan standar yang diremajakan dan ditumbuhkan dalam media MRS broth dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Pembuatan spike ini merupakan tahapan yang menentukan tingkat pengenceran yang akan digunakan dalam tahap validasi. Kultur yang
telah ditumbuhkan dalam media selama MRSB selanjutnya dihitung jumlahnya.
13 Kultur dalam MRSB yang sudah diinkubasi selama 24 jam selama 37
o
C kemudian diencerkan sampai 10
-8
. Selanjutnya dilakukan pemupukan pada tiga tingkat pengenceran tertinggi dengan media MRSA dengan kondisi aerob dan anaerob kemudian diinkubasi pada
suhu 37°C selama 3 hari. Hasil yang diperoleh dalam tahap ini akan menentukan tingkat pengenceran yang akan digunakan dalam tahap validasi.
3.4.3 Persiapan sampel dan inokulasi kultur