8 Media MRSA merupakan media selektif yang dikembangkan oleh de Man, Rogosa, dan
Sharpe. Media ini sangat cocok digunakan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat termasuk Lactobacillus, Pediococcus, dan Leuconoctoc De Man 1960. Komposisi dari media MRSA yaitu
pepton dari kasein, ekstrak daging, ekstrak yeast, D+-glukosa, dipotasium hidrogen fosfat, tween 80, diamonium hidrogen sitrat, sodium asetat, magnesium sulfat, mangan sulfat, dan agar. Pada pH
rendah, amonium sitrat berfungsi untuk menghambat pertumbuhan sebagian besar mikroorganisme, namun memungkinkan pertumbuhan Lactobacillus. Dipotasium posfat dan sodium asetat adalah agen
buffer yang mempertahankan pH rendah. Tween 80 merupakan emulsifier. Mangan dan magnesium sulfat adalah sumber ion dan sulfat. Pepton bakteriologis dan ekstrak daging sapi menyediakan
nitrogen, vitamin, mineral, dan asam amino esensial untuk pertumbuhan. Ekstrak yeast merupakan sumber vitamin khususnya B kompleks. Meskipun media MRSA merupakan media selektif bagi
bakteri asam laktat, tetapi ada sebagian kecil bakteri lain yang dapat tumbuh pada media tersebut seperti Escherichia coli Tabel 5.
Tabel 5. Karakteristik kultur yang dapat tumbuh pada media MRSA Organisme ATCC
Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus 4356
++ Lactobacillus fermentum 9338
++ Bifidobacterium bifidum 11863
++ anaerob Escherichia coli 25922
-+ Pseudomonas aeruginosa 27853
-+ Dalam penelitian ini kondisi inkubasi bakteri dibuat secara anaerob dengan menggunakan jar
anaxomat. Menurut penelitian Shahin et al 2002 bakteri yang bersifat anaerob memiliki pertumbuhan yang lebih optimum jika diinkubasi dalam jar anaxomat dari pada dengan jar anaerob
konvensional. Bakteri dapat memiliki ukuran koloni yang lebih besar bila diinkubasi dalam suatu jar anaxomat. Jar anaxomat merupakan suatu jar yang dapat dikondisikan dengan kondisi mikroaerofilik
maupun anaerob dengan komposisi gas yang dapat diatur. Untuk mengisolasi bakteri asam laktat dari sampel biasanya digunakan media MRSA yang
ditambahkan CaCO
3
. Isolasi bakteri asam laktat pada media MRSA yang mengandung CaCO
3
sangat mudah karena ditandai dengan adanya zona terang di sekeliling koloninya. Adanya zona terang
merupakan akibat diproduksinya asam yang menetralkan CaCO
3
yang terdapat pada media selama pertumbuhan bakteri asam laktat tersebut Widyastuti dan Sofarianawati 1999. Bakteri yang
menunjukkan zona bening yang luas berarti memiliki efektifitas yang tinggi. Penelitian ini menggunakan bakteri jenis Lactobacillus sehingga digunakan media MRSA
dengan mengacu pada metode ISO 7889-2003E kondisi anaerob dan SNI 2981-2009 kondisi aerob.
2.5 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE
Menurut ISOIEC 17025-2005, validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus terpenuhi. Validasi
metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Laboratorium harus memvalidasi metode analisis jika, 1 metode
tidak baku, 2 metode yang didesaindikembangkan laboratorium, 3 metode baku yang digunakan di
9 luar lingkup yang dimaksudkan, dan 4 modifikasi dari metode baku, untuk mengkonfirmasi bahwa
metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan. Validasi harus seluas yang diperlukan untuk memenuhi kebutuhan penerapan yang ditetapkan atau bidang penerapan. Laboratorium harus
merekam hasil yang diperoleh, prosedur yang digunakan untuk validasi, dan pernyataan bahwa metode tersebut tepat untuk penggunaan yang dimaksud.
Verifikasi adalah proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode sesuai dalam memenuhi kebutuhan laboratorium. Verifikasi diperlukan karena adanya perbedaan kondisi antara
saat metode tersebut dibuat dengan metode tersebut diadopsi oleh suatu laboratorium. Tujuan verifikasi adalah untuk memastikan bahwa laboratorium atau personel penguji dapat menerapkan
metode tersebut dengan baik ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji, keterampilan, dan kompetensi. Verifikasi juga bertujuan untuk menjamin mutu hasil pengujian. Menurut USP 2007
dalam Ismail 2009, dalam melakukan verifikasi terdapat beberapa parameter yang harus diukur, yaitu untuk pengujian kualitatif yang harus diukur adalah spesisfitas, sedangkan untuk pengujian
kuntitatif yang harus diuji adalah akurasi dan presisi, seperti pada Tabel 6. Tabel 6. Parameter verifikasi untuk uji mikrobiologi
Parameter Uji kualitatif
Uji kuantitatif Akurasi
Tidak Ya
Presisi Tidak
Ya Spesifisitas
Ya Tidak
Limit deteksi Tidak
Tidak Limit kuantifikasi
Tidak Tidak
Linieritas Tidak
Tidak Kiasaran hitung
Tidak Tidak
Ketahanan Tidak
Tidak Repitabilitas
Tidak Tidak
Kekasaran Tidak
Tidak Sumber : USP 2007 dalam Ismail 2009
Dalam ISO 16140-2003 disebutkan beberapa karakteristik kinerja yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode kuantitatif yaitu akurasi, presisi, penetapan batas terendah dari
kisaran hitung limit deteksi, limit kuantifikasi, dan linieritas.
Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analit, misalnya mikroba target. Apabila suatu analit mikroba target secara
alami berada di dalam sampel atau di-spike ke dalam sampel sebagai bagian dari suatu tantangan atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali analit atau
mikroorganisme tersebut dalam konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat. Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persen recovery Sac-Singlas 2002.
Presisi adalah tingkat kesamaan antara hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi dari
suatu metode biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif relative standard deviation dari suatu seri pengukuran. Presisi dapat diukur dari tingkat repitabilitas atau tingkat reproduksibilitas dari
metode analisis yang dilakukan pada kondisi normal. Repitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam
laboratorium yang sama oleh analis yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Reproduktivitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang
10 diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang
berbeda dan peralatan yang berbeda atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama. Untuk analisis dalam matriks biologis, presisi harus diukur pada minimum 5 kali
pengukuran per konsentrasi Sac-Singlas 2002.
Menurut ISO 16140-2003 batas terendah dari kisaran hitung limit deteksi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme dalam contoh yang dapat terdeteksi, tetapi tidak terhitung sebagai nilai
sebenarnya, di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat
diterima di bawah kondisi pengujian yang disepakati.
Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi secara
langsung atau melalui transformasi matematika. Linieritas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari
hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil
analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam beberapa kasus. untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi
matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya Harmita 2004.
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan
pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan
ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboratorium dan antar analis Harmita 2004. Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus
menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi.
III. METODOLOGI PENELITIAN
