Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

20

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental murni dan dikerjakan mengikuti rancangan acak lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia-Mikrobiologi dan Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel utama

a. Variabel bebas : Konsentrasi undur-undur darat. Konsentrasi undur- undur darat adalah jumlah gram g banyaknya undur- undur darat yang dilarutkan dalam mililiter ml aquades kemudian disuntikkan pada tikus putih jantan terbebani glukosa. b. Variabel tergantung : LDDK 0-300 kadar glukosa dalam darah. LDDK 0-300 kadar glukosa dalam darah adalah besaran yang menggambarkan jumlah kadar glukosa dalam darah pada rentang waktu mulai menit ke-0 sampai menit ke-300 yang dihitung menggunakan metode trapezoid. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Variabel pengacau terkendali

a. Jenis kelamin : jantan. b. Galur spesies subyek uji : galur Wistar. c. Warna : putih. d. Berat badan subyek uji : antara 175-225 gram. e. Umur subyek uji : antara 2-3 bulan. f. Cara pemberian : peroral.

3. Variabel pengacau tak terkendali

a. Keadaan patologi subjek uji. b. Kandungan dalam undur- undur darat.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

a. hewan uji Tikus putih jantan galur Wistar, umur 2 - 3 bulan, berat badan 175-225 gram, dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. b. bahan uji Undur-undur darat Myrmileon sp. yang diperoleh dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. c. senyawa pembanding Senyawa pembanding berupa kaplet generik glibenklamida yang diproduksi oleh PT. Indofarma. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI d. pereaksi untuk pengukuran kadar glukosa darah Pereaksi yang digunakan adalah enzim Glucose GOD FSDiaSys, Germany yang terdiri atas: Tabel III. Isi pereaksi enzim Glucose GOD-PAP Reagen : Phosphat buffer pH 7,5 250 mmoll Phenol 5 mmoll 4-aminoantipyrine 0,5 mmoll Glukosa oksidase GOD ≥ 10 kUl Phenol AminoAntipirin Peroksidase PAP ≤ 1 kUl Glukosa standar 100mgdl 5,5 mmoldl e. lain- lain 1 Sodium oksalat p.a 2 mgml darah sebagai antikoagulan pada waktu pengambilan darah. 2 Glukosa monohidrat p.a Merck dengan dosis 1,75 gkgBB sebagai larutan untuk pembuatan kurva baku dan untuk uji toleransi glukosa oral yang diperoleh dari LPPT Universitas Gadjah Mada. 3 Asam benzoat p.a 0,1 b v sebagai pengawet glukosa monohidrat yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 4 Aquades sebagai cairan pelarut undur- undur darat yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 Parafin cair sebagai pelancar aliran darah dalam pengambilan sampel darah dari hewan uji, yang diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika dan Bioanalisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Alat penelitian

1 Seperangkat alat gelas Beaker glass, labu takar, gelas ukur, pengaduk merk pyrex. 2 Mortir dan stamper. 3 Jarum suntik injeksi peroral yaitu jarum suntik yang ujungnya diberi bulatan kecil dengan lubang ditengahnya agar tidak melukai hewan uji. 4 Mikropipet. 5 Sentrifuge Hettich WBA SS, Germany ,yellow tipe, microtube, surgical blade. 6 Spektrometer Ultraviolet –Visibel Optima® SP300, Japan dan kuvet 7 Alat timbang elektrik Mettler Toledo AB 204, Switzerland 8 Vortex Janke-Kankel IKA® - Labortechnik 9 Holder

D. Jalannya Penelitian

1. Determinasi binatang undur-undur darat

Determinasi binatang undur-undur darat Myrmileon sp. dilakukan di Laboratorium Entomologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Pembuatan simplisia uji

a. pengolahan bahan 1 mempersiapkan bahan mentah Pengambilan undur-undur darat dipilih dari undur-undur darat yang berbentuk larva. 2 Pembersihan Undur-undur darat yang akan diolah harus bebas dari debu, kotoran, pasir atau tanah serta terbebas dari bakteri atau jamur penyebab penyakit. b. pembuatan air halusan undur- undur darat Undur-undur darat yang telah bersih ditimbang sebanyak dua ekor, digerus dengan menggunakan mortir dan stamper sampai halus dan ditambah dengan aquades sebanyak 10 ml konsentrasi ± 0,05g10ml. Ambil sebanyak 6,3 ml kemudian ditambahkan aguadest sampai 25 ml konsentrasi ± 0,0315g25ml dan air halusan pun siap digunakan. Air halusan yang dibuat tidak menggunakan blender karena hanya memerlukan sedikit dan jumlah yang kecil jadi proses penghalusan tidak memungkinkan untuk menggunakan blender. c. Pascapengolahan Air halusan undur- undur selalu dibuat baru setiap kali akan digunakan untuk menghindari kontaminasi bakteri, pertumbuhan jamur, gangguan serangga yang dapat merusak air halusan tersebut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI d. Penetapan peringkat konsentrasi undur- undur darat Sebelumnya dilakukan penetapan dosis undur-undur darat terlebih dahulu. Berdasarkan pengalaman empiris di masyarakat, penggunaan undur- undur darat untuk menurunkan kadar glukosa darah yaitu sebanyak 2 ekor atau ± 0,05g50kgBB. Untuk manusia 70 kg dibutuhkan 0,07 g undur-undur darat dan dikonversikan ke tikus 200 gram dengan faktor konversi 0,018. 0,07 g undur- undur darat x 0,018 = 0,00126 g200g = 0,0063 gkgBB = 6,3 mgkgBB Ditentukan volume pemberiannya= 1,0 ml Perhitungan konsentrasi undur-undur darat: Volume pemberian x Konsentrasi = Dosis x Berat Badan 1,0 x Konsentrasi = 0,0063 gkgBB x 200 g Konsentrasi = 0,00126 gml = 1,26 mgml Konsentrasi undur-undur darat yang dibuat adalah 1,26 mgml Berdasarkan perhitungan maka besarnya konsentrasi undur- undur darat pada hewan uji tikus yaitu 1,26 mgml. Untuk selanjutnya digunakan satu konsentrasi dibawah dan dua diatas konsentrasi orientasi dengan penguranganpenambahan faktor perkalian 2 sehingga didapat rentang konsentrasi undur-undur darat yang digunakan adalah 0,63 mgml; 1,26 mgml; 2,52 mgml; 5,04 mgml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Preparasi bahan

a. pembuatan larutan asam benzoat p.a. 0,1 b v Serbuk asam benzoat p.a. ditimbang sebanyak 0,5 gram dan dilarutkan dengan aquades panas dalam labu takar 500 ml sampai tanda. b. pembuatan larutan stok glukosa p.a. 1 b v Glukosa monohidrat p.a. ditimbang sebanyak 1 gram dan dilarutkan dengan aquades dan menggunakan pengawet asam benzoat 0,1 b v dalam labu takar 100 ml sampai tanda. c. pembuatan larutan natrium oksalat p.a. 2 b v Natrium oksalat p.a. ditimbang sebanyak 1 gram dan dilarutkan dengan aquades dalam labu takar 50 ml sampai tanda. d. penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida Penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida mengacu pada Anonim 1979. Timbang 20 tablet, hitung bobot tablet. Jika ditimbang satu- satu, tidak boleh lebih dari 2 tablet yang masing- masing bobotnya menyimpang dari bobot rata-ratanya lebih besar dari harga yang ditetapkan kolom A, dan tidak satu tabletpun menyimpang dari bobot rata- ratanya lebih dari harga yang ditetapkan kolom B. Nilai penyimpangan bobot rata-rata kolom A dan B dapat dilihat pada tabel IV. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel IV. Keseragaman bobot tablet Penyimpangan bobot rata-rata dalam Bobot rata-rata A B 25 mg atau kurang 15 30 26 mg sampai dengan 150 mg 10 20 151 mg sampai dengan 300 mg

7.5 15

Lebih dari 300 mg 5 10 e. penentuan dosis glibenklamida Dosis glibenklamida yaitu 5 mg pada manusia dengan berat badan 70 kg, dikonversikan ke tikus 200 gram dengan faktor konversi 0,018 5 mg glibenklamida x 0,018 = 0,09 mg glibenklamida 200 gram = 0,45 mg glibenklamida kg BB Berdasarkan perhitungan maka besarnya dosis glibenklamida pada hewan uji tikus yaitu 0,45 mg kgBB. f. pembuatan larutan glibenklamida 0,1125mgml Timbang serbuk glibenklamida setara dengan 25 mg glibenklamida murni, larutkan dengan aquades dalam labu takar 10 ml sampai tanda sebagai larutan induk glibenklamida. Buat dengan konsentrasi 0,1125 mgml dalam labu ukur 10 ml dari larutan induk glibenklamida tersebut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

4. Percobaan pendahuluan

a. penetapan waktu resapan stabil glukosa standar operating time Sebanyak 25 µ l larutan glukosa standar direaksikan dengan 2,5 ml pereaksi GOD-PAP. Campuran larutan tersebut kemudian divortex dan segera diukur resapannya pada panjang gelombang 500 nm sesuai dengan yang tertulis dalam leaflet Glucose GOD FS selama 60 menit. Waktu resapan stabil yang digunakan adalah waktu inkubasi yang memberikan resapan stabil. b. penetapan panjang gelombang serapan maksimum ? maksimal Sebanyak 25 µ l larutan glukosa standar direaksikan dengan 2,5 ml pereaksi GOD-PAP. Campuran larutan tersebut kemudian divortex dan diukur pada rentang panjang gelombang 400 - 600 nm. Panjang gelombang yang menunjukkan serapan yang paling tinggi adalah panjang gelombang serapan maksimum ? maksimal. c. pembuatan kurva baku Memipet 0,75 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; dan 2,25 ml larutan glukosa monohidrat 1 bv. Penetapan kadar glukosa darah dilakukan seperti pada penetapan kadar glukosa darah dengan metode GOD-PAP. Resapan diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang serapan maksimum ? maksimal. d. penetapan waktu pemberian glibenklamida Tujuan dari penetapan pemberian glibenklamida adalah untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek hipoglikemik glibenklamida, agar pada saat uji toleransi glikosa oral UTGO glibenklamida sudah memberikan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI efek penurunan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 6 ekor tikus yang terbagi dalam 3 kelompok dimana masing- masing kelompok diberi perlakuan perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif. Perlakuan tersebut dilakukan terhadap masing- masing kelompok yaitu pada menit ke-15 sebelum UTGO untuk kelompok kesatu, menit ke-30 sebelum UTGO untuk kelompok kedua, dan menit ke-45 sebelum UTGO untuk kelompok ketiga. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15 bv; 1,75 gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDKK 0- 300 . Penentuan waktu pemberian undur-undur darat didasarkan pada harga selisih LDKK 0-300 kontrol positif dan negatif tertinggi. e. penetapan waktu pemberian undur-undur darat Penetapan waktu pemberian undur-undur darat digunakan untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek penurunan kadar glukosa darah, agar pada saat dilakukan UTGO undur-undur darat sudah memberikan efek dalam menurunkan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 3 ekor tikus yang masing- masing diberi undur-undur darat pada menit ke-15, 30, dan 45 sebelum UTGO. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15 bv; 1,75 gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDKK 0-300 . Penentuan waktu pemberian undur-undur darat didasarkan pada harga LDKK 0-300 terendah . f. pengelompokan dan perlakuan hewan uji Penelitian ini mengikuti rancangan acak lengkap pola searah, yang mana 35 ekor tikus dibagi secara acak menjadi 7 kelompok, masing- masing kelompok terdiri dari 5 ekor. Tiap hewan uji diadaptasikan dengan kondisi yang sama, jauh dari kebisingan dan dihindarkan dari stress. Sebelum mendapat perlakuan, masing- masing kelompok dipuasakan selama 18 jam dengan tetap diberi minum ad libitum, lalu diberi perlakuan sebagai berikut: 1 Kelompok I Aquades 5 ml kg BB kontrol negatif untuk perlakuan undur- undur darat 2 Kelompok II Larutan CMC 1 bv 5mlkg BB kontrol negatif untuk perlakuan glibenklamida 3 Kelompok III Larutan glibenklamida 0,45 mgkgBB kontrol positif 4 Kelompok IV Undur-undur darat dosis 6,3 mgkgBB dengan konsentrasi 0,63 mgml PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 Kelompok V Undur-undur darat dosis 6,3 mgkgBB dengan konsentrasi 1,26 mgml 6 Kelompok VI Undur-undur darat dosis 6,3 mgkgBB dengan konsentrasi 2,52 mgml 7 Kelompok VII Undur-undur darat dosis 6,3 mgkgBB dengan konsentrasi 5,04 mgml Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15 bv; 1,75 gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kur va UTGO dan perhitungan harga LDKK 0-300 .

5. Penetapan kadar glukosa darah

Kadar glukosa darah ditetapkan dengan metode GOD-PAP. Pada tiap kelompok dilakukan pengambilan cuplikan darah sebanyak 0,5 ml melalui vena lateralis ekor dan ditampung dalam microtube yang berisi 50 µ l sodium oksalat 2. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 setelah UTGO. Kemudian darah geoxalated ini dipusingkan 3000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya diambil 0,025 ml plasma darah, kemudian dilakukan pengukuran seperti dalam tabel V PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel V. Volume pengukuran kadar glukosa darah Bahan Sampel ml Standar ml Blangko ml Supernatan 0.025 - - Larutan baku glukosa - 0,025 - Asam benzoat 1 b v - - 0,025 Pereaksi GOD-PAP 2,5 2,5 2,5 Bahan-bahan tersebut dicampur dan diinkubasi selama operating time. Kemudian kadar glukosa darah ditetapkan secara spektrofotometri visibel menggunakan metode GOD-PAP. Resapan diukur pada panjang gelombang maksimum. Kemudian kadar glukosa darah dihitung dengan rumus: Kadar glukosa = A s A st x 100 mg Keterangan : A s = resapan sampel A st = resapan standar Selanjutnya dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke 300 dengan metode trapezoid LDDK 0-300 dan rumus yang digunakan adalah sebagai berikut: LDDK to-tn = t 1 – t o x C o + C 1 + t 2 – t 1 x C 2 + C 1 + 2 2 t 3 – t 2 x C 3 + C 2 + t n – t n-1 x C n + C n-1 2 2 Keterangan: t = waktu jam-1menit-1 C = konsentrasi zat dalam darah mgml LDDK to-tn = luas daerah di bawah kurva dari waktu ke-0 sampai ke-n PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

E. Analisis Hasil

Data kadar glukosa darah pada tiap kelompok dianalisis secara statistik menggunakan metode General-Linier Model Repeated Measured. Dari harga LDDK 0-300 glukosa darah dilakukan uji distribusi menggunakan uji Kolmogorov Smirnov kemudian jika distribusinya normal dilanjutkan dengan analisis Anova One Way dan post hoc tests LSD dengan tingkat kepercayaan 95. Jika nilai LDDK 0-300 glukosa darah mempunyai variansi yang berbeda maka dilakukan uji Kruskal Wallis dan dilanjutkan uji Mann Whitney dengan tingkat kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing- masing kelompok. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Binatang Undur-Undur Darat

Binatang undur-undur darat yang digunakan dalam penelitian ini dideterminasi agar tidak terjadi kesalahan dalam menggunakan binatang undur- undur darat sehingga pada akhirnya dapat dikonfirmasi bahwa binatang yang dipakai memang benar binatang undur-undur darat Myrmileon sp.. Bukti determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

B. Pembuatan Simplisia Uji dan Preparasi Bahan

Pembuatan simplisia uji sesuai tata cara yang tertera pada halaman 24. Preparasi bahan sesuai tata cara yang tertera pada halaman 26-27.

C. Percobaan Pendahuluan

1. Waktu resapan stabil glukosa

Reaksi antara glukosa dan reagen GOD-PAP merupakan reaksi enzimatis yang menghasilkan senyawa berwarna, karena itulah maka perlu dilakukan uji stabilitas glukosa untuk mengetahui Operating Time OT dari reaksi tersebut. Penentuan OT ini bertujuan untuk mengetahui waktu resapan saat senyawa berwarna yang terbentuk memberikan resapan yang stabil pada pengukuran PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI