lain yang akan digunakan seperti cawan petri, pinset, gunting, dan skalpel dalam kultur jaringan dibungkus dengan kertas koran yang bersih dan diikat dengan
karet gelang. Selanjutnya, botol dan alat-alat tersebut disterilkan dengan menggunakan autoklaf yang dipanaskan di atas kompor gas dengan temperatur
121
o
C, tekanan 0,15 psi selama kurang lebih 30 menit PT. Inggu Laut Abadi, 2008. Sterilisasi perlu dilakukan karena apabila peralatan-peralatan tersebut tidak
steril maka akan menyebabkan bibit yang ditanam akan terkontaminasi oleh bakteri dan dapat menyebabkan kematian.
2. Persiapan Pembuatan Media
a. Pembuatan Larutan Stok Komposisi media kultur yang diformulasikan untuk mengoptimalkan
pertumbuhan dan perkembangan tanaman krisan dikultur ke dalam komposisi media Murashige dan Skoog MS. Jumlah kimia yang diperlukan dalam kultur
jaringan rata-rata sedikit, sehingga perlu dibuat larutan stoknya. Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih
tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media yang dibuat Yusnita, 2003.
Semua larutan yang diperlukan dalam kultur jaringan dibuat larutan stoknya, kecuali unsur makro yaitu NH
4
NO
3
, KNO, CaCl
2
.2H
2
O, MgSO
4
.7H
2
O, KH
2
PO
4,
MIO dan sukrosa ditimbang secara langsung sesuai kebutuhan. Komponen dan volume larutan stok mikro yang digunakan oleh PT. Inggu Laut
Abadi dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Komponen Larutan Stok dan Vitamin Satuan Liter
Unsur Mikro
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 A2
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 B1
5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 C1
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 D2
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 E
5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Sumber: PT. Inggu Laut Abadi 2008
Keterangan: • Larutan A2 terdiri dari unsur Na
2
MoO
4
.2H
2
O, H
3
BO
4
, COCl
2
.6H
2
O, ZnSO
4
.7H
2
O, CuSO
4
.7H
2
O • Larutan B1 terdiri dari unsur MnSO
4
.4H
2
O dan inositol • Larutan C1 terdiri dari unsur KI
• Larutan D2 terdiri dari unsur Nicotinic acid, Pyridoxin acid, Thiamin, dan Glycine
• Larutan E terdiri dari unsur FeSO
4
.7H
2
O, Na
2
EDTA Berdasarkan Tabel 6, dapat diketahui komponen apa saja yang terdapat di
dalam larutan stok serta besarnya volume masing-masing unsur yang dibutuhkan dalam pembuatan media. Setelah larutan stok dibuat, pengambilannya untuk
membuat media dapat dilakukan dengan cara menggunakan pipet atau menakarnya dengan gelas ukur.
b. Pembuatan Media Tanam Media yang digunakan dalam media tanam adalah komposisi media
Murashige dan Skoog dengan konsentrasi setengah dan diberi zat pengatur
tumbuh IAA 0,1 ppm. Pembuatan media diawali dengan mencampurkan larutan stok dengan larutan makro. Larutan stok yang telah dibuat dikeluarkan dari lemari
pendingin, kemudian dicampurkan ke dalam erlenmeyer yang telah diisi aquades kurang dari satu liter dengan bahan kimia lain dari unsur makro dan sukrosa yang
sudah dtimbang sesuai dengan ketentuan. Unsur-unsur yang terkandung dalam larutan makro serta volume yang dibutuhkan oleh setiap unsur dapat dilihat pada
Tabel 7. Tabel 7. Komponen Larutan Makro
Satuan Liter Unsur makro
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
NH
4
NO
3
0,825 1,65 2,475 3,3 4,125 4,95
KNO 0,95 1,9 2,85 3,8 4,75
5,7 CaCl
2.
2H
2
O 0,22 0,44 0,66 0,88 1,1 1,32 Mg SO
4
.7H2O 0,185 0,37 0,555 0,74 0,925 1,11
KH
2
PO
4
0,085 0,17 0,255 0,34 0,425 0,51
Myo Inositol 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
0,3 Sukrosa
15 30 45 60 75 90
Sumber: PT. Inggu Laut Abadi 2008 Setiap
memasukkan suatu
unsur, erlenmeyer
harus digoyang-goyang sampai bahan-bahan kimia tersebut benar-benar larut. Setelah itu, larutan tersebut
dicampur ke dalam tiga liter aquades dan diaduk-aduk hingga merata. Sebelum dicampur dengan agar-agar, larutan diukur kadar pH-nya. Kadar pH normal
berkisar antara 6-7 dan apabila kadar pH larutan dibawah 6 maka akan membuat agar-agar menjadi encer. Jika kadar pH sudah sesuai dengan standar, bahan agar-
agar dimasukkan ke dalam larutan. Kemudian larutan tersebut dimasak sampai mendidih. Setelah mendidih, larutan dituangkan ke dalam botol eksplan yang
sudah steril kurang lebih sebanyak 10 cc dan langsung ditutup dengan menggunakan plastik tahan panas dan diikat dengan menggunakan karet gelang.
Selanjutnya seluruh botol yang sudah diisi larutan kimia disterilkan kembali dengan menggunakan autoklaf kurang lebih selama satu jam. Sesudah proses
sterilisasi, botol-botol dikeluarkan dari autoklaf dan langsung dimasukkan ke dalam ruang inkubasi. Ruangan ini dilengkapi dengan Air Conditioner AC
dengan suhu ± 14
o
C serta lampu yang berguna untuk menjaga kelembaban ruangan. Media yang telah dibuat harus segera digunakan dan tidak dapat
disimpan lebih dari satu bulan.
3. Menyiapkan Eksplan
