19 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmasi Laboratorium Penelitian I dan Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret
– Agustus 2013.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari : neraca analitik, erlenmeyer, gelas beker, gelas ukur, spatula, kertas
saring, batang pengaduk, kaca arloji, cawan penguap, pipet tetes, lumpang dan stamper, blender, vaccum rotary evaporator, krus,
desikator, oven, spuit, sonde, stopwatch, kandang tikus, timbangan hewan, pletsimometer, sarung tangan, masker, alumunium foil, label,
kapas.
3.2.2 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah lumut hati Mastigophora diclados mastigophoraceae yang diambil di
pohon batang pinus dan batang agathis pada ketinggian 800 m blok 55, Gunung Slamet, Purwokerto, sebanyak 2,220 kg basah,
serbuk kering simplisia 2,203 kg, simplisia yang digunakan dalam ekstraksi sebanyak 2,103 kg dengan warna hijau dan bau khas
aromatis.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.2.3 Bahan Kimia
Bahan untuk uji efek antiinflamasi yang digunakan adalah karagenan jenis kappa untuk induksi radang yang diperoleh dari Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, asam asetil salisilat sebagai zat
pembanding diperoleh dari Laboratorium Penelitian Kimia Obat Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, natrium karboksimetil selulosa Na CMC, dan NaCl
fisiologis 0,9. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-heksan, etil
asetat. Sedangkan bahan untuk penapisan fitokimia adalah kloroform, amonia, pereaksi dragendorf, pereaksi meyer, HCl, H
2
SO
4,
FeCl
3
, NaOH, etil asetat dan aquadest.
3.2.4 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan strain Sprague Dawley umur 2-3 bulan dengan bobot badan berkisar
antara 200-250 g Widiyantoro, 2012. Hewan tersebut diperoleh dari Gajah Mada Veterinary Gamavet, Yogyakarta yang disimpan dalam
kandang tikus pada suhu ruang, lampu dalam keaadaan hidup selama 12 jam dan lampu keadaan mati selama 12 jam, diberikan
makanan standar dan diberikan minum air.
3.3 Rancangan Prosedur Kerja
3.3.1 Preparasi Sampel
1 Pengumpulan dan penyediaan lumut hati Mastigophora diclados.
2
Lumut hati Mastigophora diclados disortasi basah, dicuci dengan air sampai bersih, dikeringanginkan dalam ruangan, disortasi
kering, ditimbang kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Lumut Hati Mastigophora
diclados
Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Lumut Hati Mastigophora diclados dilakukan dengan cara remaserasi bertingkat, diawali dengan
perendaman menggunakan pelarut n-heksan, kemudian etil asetat, dan terakhir metanol. Campuran bubuk daun dan pelarut tersebut
dimaserasi direndam sampai diperoleh filtrat jernih Asmaliyah, 2010. Pada penelitian ini yang diambil adalah ekstrak etil asetat. Oleh
karena itu, setelah dimaserasi dengan etil asetat, maserat disaring dan dipekatkan dengan rotary evaporator. Dihitung hasil rendemen
ekstrak dengan rumus : rendemen ekstrak =
Bobot ekstrak yang didapat Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi
x
100
3.3.3 Penapisan Fitokimia Ayoola, et al., 2008
1. Uji Antraquinon
Sejumlah ekstrak didihkan bersama asam sulfat H
2
SO
4
lalu disaring selagi hangat. Filtrat yang dihasilkan ditambah dengan 5
mL kloroform dan dikocok. Lapisan kloroform dipipet dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang lain dan ditambahkan 1
mL ammonia. Perubahan warna yang terjadi pada larutan mengindikasikan adanya antraquinon.
2.Uji Terpenoid
Sejumlah ekstrak ditambahkan dengan 2 mL kloroform. Kemudian dengan hati-hati ditambahkan H
2
SO
4
pekat 3 mL sampai membentuk lapisan. Terbentuknya warna merah
kecoklatan menunjukkan adanya terpenoid.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. Uji Flavonoid
Tiga metode yang digunakan untuk menguji flavonoid. 1
Amonia encer 5 mL ditambahkan ke sebagian filtrat encer dari ekstrak. Kemudian asam sulfat pekat 1 mL
ditambahkan. Sebuah warna kuning yang hilang menunjukkan adanya flavonoid.
2 Beberapa tetes larutan aluminium 1 ditambahkan ke
sebagian dari filtrat. Terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.
3 Sebagian dari ekstrak dipanaskan dengan 10 mL etil asetat
yang telah diuapkan selama 3 menit. Campuran kemudian disaring dan 4 mL filtrat dikocok dengan penambahan 1
mL larutan amonia encer. Terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.
4. Uji Saponin
Sejumlah ekstrak ditambahkan 5 mL aquades dalam tabung reaksi. Larutan dikocok kuat dan diamati. Terbentuknya
busa stabil menunjukkan adanya saponin.
5. Uji Fenolik
Sejumlah ekstrak dalam 10 mL air dididihkan dalam tabung reaksi kemudian disaring. beberapa tetes besi klorida
0,1 ditambahkan dan diamati, terbentuknya warna hijau kecoklatan atau biru-hitam menunjukkan adanya fenolik.
6. Uji Alkaloid
Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam asam klorida encer, dipanaskan kemudian disaring. 5 mL filtrat ditambahkan dengan 2
mL amonia dan 5 mL kloroform, dikocok. Lapisan kloroform ditambahkan etil asetat 10 mL. Filtrat kemudian dibagi dua.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1. Uji Mayer : Filtrat diberi reagen mayer, terbentuknya
endapan berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid. 2.
Uji Dragendroff : Filtrat diberikan reagen dragendroff, terbentuknya endapan merah menunjukkan adanya alkaloid.
3.3.4
Uji Parameter Non-Spesifik Ekstrak Depkes RI, 2000 1.
Uji Kadar Air
Ditimbang seksama 1 g ekstrak dalam krus porselen bertutup yang sebelumnya telah ditara. Krus yang berisi ekstrak
kemudian dikeringkan pada suhu 105 C selama 5 jam dan
ditimbang. Pengeringan dilanjutkan dan ditimbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak
lebih dari 0,25.
2. Uji Kadar Abu Total
Ditimbang 2 g ekstrak dengan seksama ke dalam krus yang telah ditara, dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis,
didinginkan, ditimbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, disaring melalui kertas saring
bebas abu. Dipijarkan dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap,
ditimbang. Dihitung kadar abu total terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.3.4 Uji Efek Antiinflamasi
Uji aktivitas antiinflamasi atau anti radang dilakukan berdasarkan kemampuan ekstrakfraksisenyawa aktif mengurangi
atau menekan derajat udema pembengkakan karena radang yang diinduksi zat penyebab radang pada hewan percobaan Widiyantoro
et al., 2011.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada penelitian ini, induksi udema dilakukan pada kaki tikus dengan cara penyuntikan suspensi karagenan 1 0,2 mL intraplantar.
a. Percobaan Pendahuluan
Percobaan pendahuluan dilakukan untuk mencari dosis yang mempunyai efek terhadap hewan percobaan. Dosis yang
diberikan untuk percobaan pendahuluan adalah 10, 100, dan 1000 mgkg BB. Dari hasil percobaan menunjukkan bahwa
dosis 1000 mgkg BB menyebabkan kematian semua hewan coba dalam satu kelompok dalam kurun waktu 24 jam. Sedangkan pada
dosis 10 dan 100 mgkg BB mampu menunjukkan efek positif dan setelah dianalisa secara statistik hasil hambat udem dari
kedua dosis belum menunjukkan perbedaan yang bermakna pada taraf uji statistik 0,05 ρ ≥ 0,05, maka dilakukan
pengujian lagi dengan penurunan dosis di bawah dosis 100 mgkg BB, yaitu dosis 50 mgkg BB dan penurunan dosis di bawah dosis
10 mgKgBB, yaitu dosis 5 mgKg BB.
b. Pengelompokan Hewan Percobaan
Jumlah hewan percobaan yang digunakan menurut WHO adalah 5 ekor untuk tiap kelompok. Dalam penelitian ini
digunakan 5 ekor tikus untuk masing-masing kelompok. Tikus dikelompokkan menjadi 6 kelompok, dimana masing-
masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus dengan rincian sebagai berikut :
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 3.1 Pembagian Kelompok Hewan Uji Antiinflamasi
Kelompok Jumlah Tikus
Perlakuan
1 5
Kelompok kontrol negatif : diberi suspensi Na CMC 0,5
2 5
Kelompok kontrol positif : diberi suspensi asetosal dalam Na CMC
0,5
3 5
Kelompok uji 1: diberi suspensi ekstrak etil asetat Mastigophora
diclados dalam Na CMC 0,5 dengan dosis 5 mgkg BB
4 5
Kelompok uji 2: diberi suspensi ekstrak etil asetat Mastigophora
diclados dalam
Na CMC
0,5 dengan dosis 10 mgkg BB
5 5
Kelompok uji 3: diberi suspensi ekstrak etil asetat Mastigophora
diclados dalam Na CMC 0,5 dengan dosis 50 mgkg BB
6 5
Kelompok uji 4: diberi suspensi ekstrak etil asetat Mastigophora
diclados dalam Na CMC 0,5 dengan dosis 100 mgkg BB
c. Penyiapan Hewan Percobaan