bagian bening dan endapannya. Bagian bening digunakan sebagai sampel dalam analisa. Dipipet 1 mL sampel ke dalam labu ukur 25 mL ditambahkan aquadest
sampai tepat tanda batas. Dari hasil pengenceran diambil 0,1 mL dan ditambahkan
aquadest 0,9 mL ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 1 mL larutan Nelson campuran Nelson A + Nelson B, tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas,
dipanaskan 20 menit, lalu dinginkan. Ditambahkan 1 mL arseno molibdat, kocok, ditambahkan aquadest sampai volumenya 10 mL, dihomogenkan. Baca
absorbansinya pada λ 520 nm, warna kompleks yang terbentuk hijau.
Kadar gula pereduksi = konsentrasi x fp Keterangan : Konsentrasi = konsentrasi gula pereduksi sampel yang tertera
pada spektrofotometer fp
= faktor pengenceran
4. Penentuan Kadar Protein Terlarut Metode Lowry AOAC, 1990
Prinsip penentuan kadar protein terlarut metode Lowry yaitu reagen Folin- Ciocalteau dapat mendeteksi residu tirosin yang mengandung gugus fenolik
melalui reaksi reduksi oksidasi dimana gugus fenolik tirosin akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen tersebut menjadi
tungsten dan molibden yang berwarna biru. Pereaksi : Larutan I = Na
2
CO
3
2 dalam NaOH 0,1 N Larutan
II =
CuSO
4
0,5 dalam NaK-tartrat 1 Larutan III = 50 mL larutan I + 1 mL larutan II
Larutan IV
= Folin
Ciocalteu + aquadest 1:1 Larutan V = Standar protein BSA 0,25 mgmL
Pembuatan kurva standar :
62
Larutan BSA bovine serum albumin dimasukkan masing-masing ke dalam tabung reaksi : 0 mL blanko; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 mL protein
standard kemudian ditambah aquadest sampai volume 4 mL. Larutan III ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 5,5 mL lalu dikocok dan dibiarkan
selama 15 menit. Ditambahkan larutan IV ke dalam tabung sebanyak 0,5 mL, kemudian dikocok dan dibiarkan selama 30 menit sampai terbentuk warna biru.
Kemudian diukur absorbansinya pada 650 nm. Penetapan sampel:
1 mL autolisat terlebih dahulu dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diencerkan dengan penambahan air sebanyak 9 mL, divortex lalu diamkan hingga
terpisah bagian bening dan endapannya. Bagian bening digunakan sebagai sampel dalam analisa. Dipipet sampel sebanyak 0,1 mL, dimasukkan ke dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan air 0,9 mL. Tambahkan 5,5 mL larutan III dan biarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 mL larutan IV ke
dalam masing-masing tabung reaksi, vortex segera setelah penambahan lalu diamkan 30 menit pada suhu kamar sampai warna biru terbentuk. Ukur
absorbansinya pada 650 nm. Kadar Protein Terlarut mgmL = konsentrasi x fp
Keterangan : Konsentrasi = konsentrasi protein terlarut sampel yang tertera pada spektrofotometer
fp =
faktor pengenceran
5. Penentuan Kadar Protein Total Metode Kjeldahl AOAC, 1990
Penetapan kadar protein total dengan metode ini didasarkan pada oksidasi bahan mengandung karbon dan konversi nitrogen menjadi ammonia. Selanjutnya
ammonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk ammonium sulfat. Larutan
63
dibuat menjadi basa dan ammonia diuapkan untuk kemudian diserap dalam larutan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan dapat ditentukan
jumlahnya dengan titrasi menggunakan HCl. Sebanyak 1 gram autolisat ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu
Kjeldahl labu destruksi, kemudian tambahkan 0,5 gram garam Kjeldahl dibuat dari campuran Na
2
SO
4
dan CuSO
4
.5H
2
O dengan perbandingan 2:1 sebagai katalisator. Ditambahkan 5 mL H
2
SO
4
pekat lalu sampel didestruksi selama ± 2 jam sampai diperoleh larutan berwarna hijau bening dan asapnya hilang semua.
Hasil destruksi diencerkan dengan aquadest 50 mL. Dilakukan destilasi dengan
penambahan NaOH 30 ke dalam labu destruksi ± 25-40 mL selama 5 menit
sampai diperoleh cairan destilat sebanyak 100 mL. Cairan destilat ditampung
dalam erlenmeyer berisi H
3
BO
3
3 sebanyak 15 mL yang telah diberi 4 tetes indikator MM dan MB. Kelebihan H
3
BO
3
pada destilat dititrasi dengan larutan
HCl 0,1 N.
Kadar N total =
007 .
14
tan
mg W
x xN
V V
sampel HCL
HCL HCL
dar s
blanko sampel
−
x 100 Kadar protein = N x faktor konversi
Kadar protein total berat kering = A
100 100
− x kadar protein
Keterangan : = 0,05 mL
blanko
HCl
V = 0,1397
dar s
HCl
N
tan
Faktor konversi kacang = 6,25 A = kadar air yang telah diukur
6. Penentuan Kadar Lemak Metode Soxhlet AOAC,1990
