a. Langkah-langkah Pengolahan Sampel Darah: 1
Persiapan Buffer, Biotin, Streptaviridin, Standar VEGF-A
Konsentrat buffer sebaiknya berada dalam temperatur ruangan dan sebaiknya dilarutkan sebelum melakukan prosedur pemeriksaan. Jika
terbentuk kristal di dalam konsentrat buffer, dapat dihangatkan sedikit hingga terlarut secara menyeluruh.
Buffer pencuci
Dituangkan 50 ml konsentrat buffer pencuci 20x ke dalam tabung 1000 ml. Dilarutkan hingga mencapai volume 1000 ml dengan air de-
ionisasi atau akuades, dicampurkan perlahan untuk menghindari pembentukan busa. Kemudian dipindahkan ke dalam botol pencuci
dan disimpan pada temperatur 2
o
hingga 25
o
C. Larutan buffer pencuci ini 1x stabil selama 30 hari.
Buffer penguji
Dituangkan semua isi 5 ml kosentrat buffer penguji 20x ke dalam tabung 100 ml, dan dilarutkan hingga mencapai volume 100 ml dengan
akuades. Kemudian dicampurkan perlahan untuk menghindari pembentukan busa dan disimpan pada temperatur 2
o
hingga 8
o
C.
Larutan buffer pencuci ini 1x stabil selama 30 hari
Universitas Sumatera Utara
Konjugat Biotin
Larutan konjugat Biotin harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran. Dibuatlah larutan 1:100 dari konsentrat
konjugat Biotin dengan Buffer penguji 1x dalam tabung plastik bersih. 0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji atau
0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji.
Streptavidin-HRP
Larutan Streptavidin HRP harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran. Kemudian dibuat larutan 1:100 dari
konsentrat Streptavidin-HRP dengan Buffer penguji 1x dalam tabung plastik bersih. 0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji
atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji.
Standar VEGF-A manusia
Rekonstitusi VEGF-A manusia standar dengan menambahkan akuades. Volume rekonstitusi ditentukan dari label tabung standar.
Digoyangkan atau dicampurkan perlahan untuk memastikan proses pelarutan yang homogen konsentrasi standar rekonstitusi = 2 ngml.
Rekonstitusikan standar selama 30 menit, dan dicampurkan dengan baik sebelum melakukan pelarutan berikutnya. Setelah digunakan,
larutan standar yang tersisa tidak dapat disimpan dan harus dibuang. Pelarutan standar dapat dilakukan secara langsung pada plat sumur
Universitas Sumatera Utara
mikro atau secara alternatif pada tabung lain. Kemudian diambil dengan menggunakan pipet sejumlah 225
µl pengencer sampel pada setiap tabung. Setelah itu ambil sebanyak 225
µl standar ter- rekonstitusi 2ngml dengan menggunakan pipet ke dalam tabung
pertama, berikan tanda S1 dan kemudian dicampurkan konsentrasi 1ngml, kemudian dengan pipet sejumlah 225
µl larutan S1 ke dalam tabung kedua, berikan label S2 dan kemudian dicampurkan.
Selanjutnya dilakukan dilusi serial lima kali lagi sehingga dapat membentuk kurva standar.Pengencer standar digunakan sebagai
blanko.
Universitas Sumatera Utara
2 Prosedur pengujian:
a Ditentukan jumlah sumur yang akan dibutuhkan untuk melakukan pengujian jumlah sampel ditambahkan dengan blanko dan standar.
Setiap sampel, standar, blanko, dan sampel kontrol sebaiknya diuji sebagai duplo. Dilepaskan sumur-sumur yang tidak dipakai dari
pemegang dan simpan dalam kantong aluminium dengan pengering yang telah disediakan pada temperatur 2
o
-8
o
dengan pengemasan ketat.
b Sumur mikro dicuci dua kali dengan sekitar 400 µl, buffer pencuci
pada setiap sumur dengan aspirasi berulang di antara pencucian. Didiamkan buffer pencuci selama sekitar 10-15 detik sebelum
aspirasi. Perhatikan ujung pipet agar tidak menggores permukaan sumur mikro. Dikosongkan sumur dan ketukkan perlahan sumur
mikro pada handuk kertas kertas penghisap untuk menghilangkan buffer pencuci yang berlebihan. Digunakan sumur mikro segera
setelah pencucian. Cara lain: sumur mikro dapat diletakkan terbalik pada handuk kertastissue penghisap tidak lebih dari 15 menit.
Sumur mikro tidak boleh mengalami pengeringan. c Pengenceran standar:
Ditambahkan 100 µl pengencer sampel duplo terhadap semua
sumur standar. Pipetkan 100 µl larutan standar 2000 pgml duplo
pada sumur A1 dan A2. Dicampurkan kandungan sumur A1 dan A2 dengan aspirasi dan ejeksi berulang konsentrasi standar 1, S1
Universitas Sumatera Utara
= 1000 pgml, dan pindahkan 100 µl ke dalam tabung B1 dan B2.
Dilakukan proses pengenceran serial sebanyak lima kali, membentuk dua baris standar VEGF-A standar dengan konsentrasi
1000 hingga 15,6 pgml. d Ditambahkan 100
µl pengencer sampel duplo pada sumur kosong blanko.
e Ditambahkan 50 µl pengencer sampel pada sumur sampel.
f Ditambahkan 50 µl sampel-sampel secara duplo pada sumur
sampel. g Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25
o
C selama dua jam pada pengaduk plat mikro dengan 100 rpm.
h Dipersiapkan konjugat biotin. i Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam
kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian. j Ditambahkan 100
µl konjugat biotin. k Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25
o
C selama satu jam pada pengaduk plat mikro dengan 100 rpm.
l Dipersiapkan Streptavidin-HRP. m Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam
kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.
Universitas Sumatera Utara
n Ditambahkan 100 µl Streptavidin-HRP yang telah diencerkan pada
semua sumur, termasuk sumur blanko. o Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25
o
C selama satu jam pada pengaduk plat mikro dengan 100 rpm.
p Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.
q Dimasukkan dengan menggunakan pipet sebanyak 100 µl larutan
substrat TMB pada semua sumur. r Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25
o
C selama 30 menit. Dihindari paparan terhadap cahaya.
s Pengembangan warna pada plat sebaiknya terus diperhatikan dan reaksi substrat distop sebelum tidak dapat diukur lagi. Penentuan
waktu yang ideal untuk setiap pengembangan warna harus dilakukan secara individual terhadap setiap pengujian.
t Direkomendasikan untuk menambahkan larutan stop ketika standar tertinggi telah berwarna biru gelap. Cara lain dengan menggunakan
reader ELISA pada 620 nm. Reaksi substrat sebaiknya distop ketika standar 1 mencapai OD 0,9 – 0,95.
u Stop reaksi enzimatik dengan memberikan 100 µl larutan stop
secara cepat pada setiap sumur. Hasil harus dibaca segera setelah
Universitas Sumatera Utara
larutan stop diberikan atau dalam satu jam jika disimpan pada suhu 2-8
o
C dalam keadaan gelap. v Pembacaan absorbansi dilakukan di setiap sumur mikro pada
spektrofotometer dengan menggunakan 450 nm sebagai gelombang cahaya primer dapat juga menggunakan 610 - 650nm.
Alat Ukur : Pengukuran dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 Awareness Technology, Inc.
Hasil Ukur : Hasil ukur akan didapat dalam satuan pgml.
3 Prinsip Pengujian :
Coating antibody anti-VEGF-A manusia ditempelkan pada sumur-
sumur mikro.
Keberadaan VEGF-A manusia pada sampel atau standar akan
berikatan dengan antibodi yang telah ditempelkan pada sumur-
sumur mikro.
Universitas Sumatera Utara
Setelah dilakukan inkubasi, komponen-komponen biologis
dibuang dengan melakukan tahap pencucian. Antibodi terhadap
VEGF-A manusia yang telah dikonjugasikan dengan biotin
ditambahkan dan akan berikatan dengan VEGF-A yang telah
ditangkap oleh antibodi yang telah ditambahkan pertama kali.
Setelah dilakukan inkubasi, antibodi anti-VEGF-A manusia
yang terkonjugasi dengan biotin yang tidak berikatan akan dibuang
dengan tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan
dan berikatan pada antibodi anti- VEGF-A manusia yang
terkonjugasi dengan biotin.
Setelah dilakukan inkubasi, streptavidin-HRP yang tidak
berikatan dibuang dengan tahap pencucian, kemudian larutan
substrat reaktif terhadap HRP ditambahkan pada sumur-sumur
Universitas Sumatera Utara
pemeriksaan. Reaksi antara substrat reaktif yang
berikatan dengan HRP akan menghasilkan produk berwarna
berhubungan dengan proporsinya terhadap keberadaan VEGF-A
manusia yang terkandung dalam sampel atau standar. Reaksi ini
dihentikan dengan menambahkan larutan bersifat asam. Kandungan
VEGF-A didapat dengan mengukur absorbansi pada 450
nm. Kurva standar dibuat dari 7 standar VEGF-A dengan beberapa
pengenceran, sehingga kadar VEGF-A sampel dapat ditentukan.
3.6 Definisi Operasional
Kategori