35 b.
Sifat penjerap c.
Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap d.
Pelarut dan derajat kemurniannya e.
Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f.
Teknik percobaan g.
Jumlah cuplikan yang digunakan h.
Suhu i.
Kesetimbangan.
2.4.2 Kromatografi cair vakum
Cara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll dkk., pada tahun 1977 dengan menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk
mengisolasi diterpena sembrenoida dari terumbu karang Australia. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan
kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai
kering dan sekarang siap dipakai Hostettmann, et al., 1995. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada
bagian atas kolom atau pada lapisan penjerap dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut
yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap
pengumpulan fraksi, oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak Hostettmann, et al.,
1995.
Universitas Sumatera Utara
36
2.4.3 Kromatografi kolom
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar
lebih dari 1 g, kadang-kadang cara ini disebut kromatografi cair preparatif KCP = PLC. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan
berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada pada tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik. Pelarut fase gerak dibiarkan mengalir melalui
kolom, karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa bergerak melalui melalui kolom dengan laju yang berbeda,
memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom Sastrohamidjojo, 1985.
2.4.4 Kromatografi lapis tipis preparatif
Kromatografi lapis tipis KLT preparatif merupakan salah satu metode pemisahan dengan menggunakan peralatan sederhana. Ketebalan penjerap yang
sering dipakai adalah 0,5-2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20x20 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah
bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel Hostettmann, et al., 1995.
Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan jarak sesempit mungkin karena
pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pelarut yang baik untuk melarutkan
cuplikan adalah pelarut yang atsiri. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap
Universitas Sumatera Utara
37 jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang diletakkan
berdiri disekeliling permukaan bagian dalam bejana Hostettmann, et al., 1995. Kebanyakan penjerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi
yang membantu mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet. Untuk mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet
yaitu dengan cara menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi dengan penyemprot Hostettmann, et al., 1995.
Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak maka senyawa yang tidak berwarna dengan penjerap dikerok dari plat kaca. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran beberapa senyawa sehingga diperoleh senyawa murni Gritter, et al., 1991.
2.4.5 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC
