i. Tentukan densitas optis pada setiap well segera, dengan menggunakan alat pembaca microplate yang disetting 450
nm dan 540 nm. Kurangi pembacaan pada 540 nm dari nilai bacaan pada 450 nm. Pengurangan ini akan mengoreksi
imperfeksi optis pada plate. Pembacaan yang dihasilkan secara langsung pada 450 nm tanpa koreksi dapat
menyebabkan pembacaan yang lebih tinggi daripada pembacaan yang sebenarnya.
3. Perhitungan hasil Berdasarkan standar, dibuat sebuah kurva dengan
konsentrasi pada sumbu X dan optical density pada sumbu Y. Nilai optical density sampel pada 450 nm kemudian diplot
ke dalam kurva untuk mendapatkan hasil.
3.11.2 Cara pengukuran kadar BDNF dalam serum
Pengukuran dilakukan menurut protokol BDNF Human ELISA Kit dari Abnova.
Persiapan reagensia: a. Persiapan plat. Plat dibilas dengan 0,3 cc PBS atau TBS
selama 1-2 menit. Pencucian diulangi sampai 3 kali. b. Persiapan standar human BDNF. Larutan standar BDNF
dengan konsentrasi 10000 pgmL diencerkan. Ambil 0,2 cc standar BDNF, kemudian dicampur dengan 0,8 cc sampel
diluent buffer sampai terbentuk larutan dengan konsentrasi
Universitas Sumatera Utara
2000 pgmL. Kemudian, dilakukan kembali pengenceran enam kali berturut-turut dengan konsentrasi 1000 pgmL 500
pgmL, 250 pgmL, 125 pgmL, 62,5 pgmL, dan 32 pgmL. c. Persiapan sampel. Darah dibiarkan membeku dalam serum
separator tube selama 30 menit pada suhu ruangan. Kemudian, dilakukan sentrifugasi 1000 kali selama 15 manit.
Serum kemudian dipisahkan dan disimpan pada suhu -20 C
Prosedur Assay •
0,1 cc dari setiap larutan standar BDNF dengan konsentrasi 31,2 pgmL sampai 2000 pgmL. 0,1 cc sampel diluent buffer,
dimasukkan ke dalam sumur kontrol dan kemudian tambahkan 0,1 cc dari sampel yang sudah dilarutkan ke setiap sumur yang kosong.
• Piring ditutup dan diinkubasikan pada suhu 37
• Penutup dibuka, isi piring dibuang, dan usap dengan kertas toilet
atau bahan penyerap lainnya. Sumur tidak boleh dibiarkan kering total.
C selama 90 menit.
• Tambahkan 0,1 cc biotinylated anti-human BDNF antibody working
solutio pada setiap sumur dan inkubasikan piringan pada suhu 37
• Cuci piring tersebut 3 kali dengan 0,01 M TBS dan 0,01 PBS dan
setiap kalinya, buffer pencuci dibiarkan pada sumur selama 1 menit. Buang larutan pencuci dan usap piring dengan kertas toilet
atau bahan penyerap lain. C selama 60 menit.
Universitas Sumatera Utara
• Tambahkan 0,1 cc larutan kerja ABC pada setiap sumur dan
inkubasikan pada suhu 37 •
Piringan dicuci lima kali dengan 0,01 M TBS atau 0,01 M PBS, dan setiap kalinya, cairan buffer pencuci dibiarkan pada piringan selama
1-2 menit. Buffer pencuci dibuang dan piringan diusap dengan kertas toilet atau bahan penyerap lainnya.
C selama 30 menit.
• Tambahkan 90
μl TMB color developing agentin pada setiap lubang dan piringan diinkubasi pada suhu 37
• Tambahkan 0,1 cc TMB stop solution pada setiap lubang. Warna
akan segera berubah C selama 15-20 menit
bayangan berwarna biru dapat terlihat pada empat lubang dengan konsentrasi BDNF standar yang tinggi.
• Kemudian, dilakukan penghitungan optical density pada 450 nm
dalam sebuah microplate reader setelah menambahkan stop solution selama 30 menit.
Cara Penghitungan •
Densitas optik = densitas optik sumur sampel pada 450 nm – densitas optik zero well. Nilai kemudian diplot pada kurva standar.
Sumbu X kurva standar merupakan konsentrasi dan sumbu Y merupakan optical density.
Universitas Sumatera Utara
3.12 Ethical clearance
