Waktu dan Tempat Penelitian Fiksasi Perlakuan processing jaringan Pemotongan jaringan

III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai Desember 2011 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. Sedangkan proses pengekstraksian K. alvarezii dilakukan di Laboratorium Teknologi Hasil Perikanan Institut Pertanian Bogor.

3.2 Persiapan Penelitian

Ikan uji yang akan digunakan adalah ikan lele dumbo dengan berat 15–30 gram yang berasal dari petani ikan lele di Ciampea Bogor. Sebelum digunakan dalam percobaan, ikan lele dipelihara dalam bak pemeliharaan yang dilengkapi dengan aerator. Selama pemeliharaan ikan diberi pakan komersial dua kali sehari dengan FR feeding rate 3. Air yang akan digunakan dalam percobaan, disaring dan diendapkan, selanjutnya ditampung dalam bak fiber dan diaerasi. Wadah perlakuan yang digunakan berupa akuarium berukuran 60x30x40 cm 3 yang dilengkapi peralatan aerasi. Sebelum digunakan, akuarium dibersihkan dan disterilisasi dengan kaporit 30 ppm selama 24 jam, kemudian dibilas dengan air bersih dan dikeringkan. Selanjutnya akuarium diisi dengan air bersih dan diaerasi. Ikan diadaptasikan dalam akuarium selama satu minggu sebelum perlakuan.

3.2.1 Ekstraksi Rumput Laut Kappaphycus alvarezii

Ekstraksi K.alvarezii untuk menghasilkan κ- karagenan menggunakan metode gell press. Caranya adalah K.alvarezii kering dibersihkan dari kotoran berupa pasir, garam dan jenis-jenis rumput laut lainnya kemudian direndam selama ± 30 menit. K.alvarezii yang telah bersih direbus dalam larutan alkali KOH 8 pada temperatur 60-90 o C selama ± 2 jam. Selanjutnya dilakukan pencucian K. alvarezii sampai netral dan direbus kembali pada suhu 90-95 o C selama ± 2 jam. Setelah direbus K. alvarezii disaring dengan vibrator screen. K.alvarezii direbus kembali dengan KCl 3 , selama ± 15 menit dengan suhu 60 o C, kemudian K.alvarezii yang telah berbentuk koloid dicetakdijedalkan dalam pan penjedal selama semalam. Koloid K.alvarezii dipotong dengan alat pemotong gel sehingga membentuk lembaran gel karagenan. Lembaran gel karagenan dibungkus dengan kain kemudian dipres dalam bak pengepres. Pengepresan dilakukan selama semalam dengan penambahan beban secara bertahap, sehingga diperoleh lembaran gel karagenan yang cukup tipis. Gel karagenan kemudian dijemur sampai kering sehingga membentuk lembaran seperti kertas tipis. Karagenan kertas kemudian dipotong-potong, digiling dan disaring dengan saringan halus 100 mesh size sehingga menjadi tepung karagenan. Tepung karagenan siap untuk digunakan.

3.2.2 Penyediaan Suspensi Bakteri A. hydrophila.

Bakteri A. hydrophila diperoleh dari Laboratorium Kesehatan Ikan Institut Pertanian Bogor. Sebelum digunakan untuk uji, bakteri tersebut ditingkatkan virulensinya dengan menginjeksikan kembali pada ikan hidup yang sehat dan selanjutnya diisolasi kembali dengan cara menusukkan jarum ose ke bagian kulitginjal kemudian dibiakkan di media TSA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruangan. Untuk mendapatkan biakan murni maka setiap koloni bakteri yang tumbuh terpisah dan berlainan morfologinya diisolasi kembali ke dalam media TSA miring dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam. Penentuan tingkat virulensi bakteri A.hydrophila dilakukan dengan menghitung lethal dosis LD -50 , yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian ikan uji sebanyak 50 . Uji LD -50 dilakukan dengan cara menginfeksi ikan lele dengan bakteri A.hydrophila pada konsentrasi 10 9 CFUml. Injeksi dilakukan secara intramuscular sebanyak 0,1 mlikan. Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah ikan yang hidup dan mati sampai hari ke-7. Kemudian dilakukan penghitungan nilai LD-50 yaitu pada konsentrasi A.hydrophila 10 8 CFUml yang mematikan ikan sebanyak 50 dari populasi pada batas waktu tertentu. Regenerasi bakteri A.hydrophila untuk uji tantang dilakukan dengan mengambil satu ose bakteri diambil dari media agar miring dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi media Luria Bertani LB, kemudian diinkubasi dalam water bath shaker selama 24 jam pada suhu 29 o C sebagai stok kultur untuk uji. Stok kultur disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit pada 4 o C. Supernatan dipindahkan dan pelet bakteri disuspensikan dalam larutan Phosphat-Buffered Saline PBS sebagai stok suspensi bakteri untuk uji tantang, dan untuk aktifitas fagositik ikan lele terhadap bakteri A. hydrophila . 3.3 Pelaksanaan Penelitian Penelitian ini terdiri atas 3 tahap yaitu : 1. Menguji pengaruh pemberian κ-karagenan dengan dosis berbeda dalam pakan terhadap infeksi bakteri A. hydrophila 2. Mengevaluasi pengaruh dosis terbaik dalam pakan terhadap perubahan parameter makroskopis dan mikroskopis. 3. Mengevaluasi frekuensi pemberian κ-karagenan yang efektif untuk ketahanan ikan lele terhadap infeksi bakteri A. hydrophila. Tahap 1. Pengaruh Pemberian K-Karagenan dengan Dosis Berbeda Dalam Pakan terhadap Infeksi Bakteri A.hydrophila Tahap penelitian ini terdiri atas lima perlakuan, masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali. Adapun perlakuan pakan dicampur bubuk k-karagenan dengan dosis sebagai berikut: K + : Pakan tanpa k-karagenan, diuji tantang dengan bakteri A.hydrophila K - : Pakan tanpa k-karagenan, diinjeksi PBS A : Pemberian k-karagenan 5 gkg -1 pakan, diuji tantang bakteri A.hydrophila B : Pemberian k-karagenan 10 gkg -1 pakan, diuji tantang bakteri A.hydrophila C : Pemberian k-karagenan 20 gkg -1 pakan, diuji tantang bakteri A.hydrophila Pemberian pakan pada ikan dilakukan 2 kali sehari dengan FR feeding rate 3 dari bobot biomassa selama empat minggu setelah itu dilakukan uji tantang dengan bakteri A. hydrophila 10 8 CFUekor kecuali kelompok kontrol negatif K- yang hanya diinjeksi dengan PBS. Cara pencampuran k-karagenan dalam pakan adalah k-karagenan ditimbang sesuai dosis perlakuan, dilarutkan dalam sedikit air, dicampurkan kedalam pakan pellet standar secara merata dan dikering-anginkan dalam suhu ruang. Setelah kering, pakan di coating dengan putih telur dan dikering-anginkan kembali. Pakan siap digunakan, selanjutnya sisanya dimasukkan ke dalam kantong plastik kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 o C sampai saat akan digunakan. Pengambilan sampel darah dilakukan pada minggu ke-0, 1, 2, 3 dan 4. Parameter imun yang diukur yaitu : kadar hematokrit, eritrosit total, leukosit total, differensial dan aktifitas fagositik. Setelah empat minggu pemeliharan dilakukan uji tantang dengan bakteri A. hydrophila 10 8 CFUekor dan dilakukan pengamatan terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan sampai hari ke- 14 setelah uji tantang. Skema Penelitian Tahap I Pemberian k-karagenan selama 30 hari Uji tantang bakteri A.hydrophila M0 M1 M2 M3 M4 1 14 Pengamatan parameter imun: SR Hb, He, SDM, SDP, DL, IF Keterangan: M Minggu; 1-14 Hari Pengamatan Tahap 2. Pengaruh Dosis Terbaik dalam Pakan terhadap Perubahan Parameter Makroskopis dan Mikroskopis pada Ikan Lele Dumbo Pada tahap ini terdiri atas tiga perlakuan dan tiga kali ulangan. Dosis yang digunakan dalam tahap ini merupakan dosis yang memberikan hasil terbaik dari tahap penelitian sebelumnya. Adapun perlakuannya sebagai berikut: K + : Pakan tanpa k-karagenan, diuji tantang dengan bakteri A.hydrophila K - : Pakan tanpa k-karagenan, diinjeksi PBS PDT : Perlakuan dosis terbaik Pemberian pakan pada ikan dilakukan 2 kali sehari dengan FR feeding rate 3 dari bobot biomassa selama empat minggu setelah itu dilakukan uji tantang dengan bakteri A. hydrophila 10 8 CFUekor kecuali kelompok kontrol negatif K- yang hanya diinjeksi dengan PBS. Pengamatan parameter makroskopis berupa gejala klinis dan diameter gejala klinis, dilakukan pada saat ikan diinjeksi dengan bakteri A. hydrophila sampai hari ke 14 setelah uji tantang. Pada akhir perlakuan dilakukan pengamatan organ dalam ginjal, hati, empedu dan limpa untuk mengetahui kelainan klinis dengan membandingkan perubahan morfologi dan warna organ dalam ikan pada perlakuan dosis terbaik, kontrol positif, dengan perlakuan kontrol negatif. Pemeriksaan histologi dilakukan pada organ kulit, ginjal, dan hati dari ikan uji. Pemeriksaan histologi dilakukan pada organ kulit, ginjal, dan hati dari ikan uji. Sampel difiksasi dengan larutan fiksatif Davidson kemudian dipindahkan ke dalam larutan alkohol 70 setelah 24 jam. Selanjutnya dilakukan dehidrasi, clearing infiltrasi dan blocking terhadap jaringan sampel. Blok jaringan selanjutnya diiris menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 µm dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin H E. Untuk pengamatan gejala klinis, dilakukan skoring berdasarkan jenis perubahannya Angka 2005 yaitu untuk radang diberi skor 1, hemoragi skor 2, tukak skor 3, dan mati skor 4. Berdasarkan diameter kelainan tersebut, ada tiga tingkatan nilai untuk radang, hemoragi dan tukak Tabel 1. Tabel 1. Cara penentuan skoring gejala klinis Jenis Skor Kisaran Diameter cm Skor Total 1 2 3 Radang 1 0,2 - 0,4 0,41- 0,6 0,6 1x1=1 1x2=2 1x3=3 Hemoragi 2 0,2 - 0,4 0,41- 0,6 0,6 2x1=2 2x2=4 2x3=6 Tukak 3 0,1 - 0,5 0,51- 1,0 1,0 3x1=3 3x2=6 3x3=9 Mati 4 Sumber : Angka 2005. Keterangan : skor radang = 1, diameter radang 0,5cm, maka total skor = 1 x 2 = 2 skor hemoragi = 2,diameter hemoragi 0,3 cm, maka total skor = 2 x 1=2 skor tukak = 3, diameter tukak 1,2 cm, maka skor = 3 x 3 = 9 Skema Penelitian Tahap II Pemberian k-karagenan selama 30 hari Uji tantang bakteri A.hydrophila M0 M1 M2 M3 M4 1 14 Gejala Klinis Pengamatan anatomi ikan lele Histopatologi Keterangan: M Minggu; 1-14 Hari Pengamatan Tahap 3. Durasi Pemberian k-Karagenan yang Efektif untuk Ketahanan Ikan Lele terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila. Penelitian tahap kedua ini terdiri dari enam perlakuan dan tiga kali ulangan. Dosis yang digunakan pada tahap ini, merupakan dosis yang memberikan hasil terbaik dari tahap penelitian sebelumnya. Perlakuan yang digunakan adalah periode waktu tertentu pemberian κ-karagenan dalam pakan sebagai berikut: K + : Pakan tanpa k-karagenan, diuji tantang dengan bakteri A.hydrophila K - : Pakan tanpa k-karagenan, diinjeksi PBS PB1 : Pemberian k-karagenan setiap hari selama lima minggu PB7 : Pemberian k-karagenan selama tujuh hari pada minggu I PB14 : Pemberian k-karagenan selama 14 hari pada minggu I dan II PB21 : Pemberian k-karagenan selama 21 hari pada minggu I, III dan V Pemeliharaan dilakukan selama lima minggu dan setelah itu dilakukan uji tantang dengan bakteri A. hydrophila 10 8 CFUekor kecuali kelompok kontrol negatif K- yang hanya diinjeksi dengan PBS. Parameter yang diamati adalah tingkat kelangsungan hidup ikan dan pertumbuhan. Kelangsungan hidup ikan diamati mulai hari ke-1 sampai hari ke-14 setelah uji tantang. Skema Penelitian Tahap III Minggu Pemberian k-karagenan Uji tantang A.hydrophila Perlakuan I II III IV V PB1 : PB7 : 1 14 PB14 : PB21 : SR K + : ………………………………………….. Uji tantang A.hydrophila K- : …………………………………………. Injeksi PBS Pertumbuhan Keterangan: : Minggu pemberian k-karagenan ................. : Minggu pemberian pakan tanpa karagenan 1-14 : Hari pengamatan 3.4 Pemeriksaan Parameter Penelitian

3.4.1 Pengambilan sampel darah

Alat suntik dan tabung eppendorf dibilas dengan dengan antikoagulan Na- sitrat 3,8 . Darah ikan diambil dengan menggunakan syringe 1 ml yang ditusukkan sampai tulang vertebrae dimana terdapat vena caudalis. Darah didiamkan mengalir secara kapiler lalu dihisap dengan ditarik secara perlahan. Darah yang telah diambil, dimasukkan ke dalam tabung eppendorf untuk segera diamati gambaran darahnya.

3.4.2 Pengukuran hematokrit Anderson Siwicki 1993

Darah dihisap menggunakan tabung mikrohematokrit berlapis heparin dengan sistem kapiler. Fungsi heparin adalah untuk mencegah pembekuan darah di dalam tabung Amlacher, 1970. Setelah darah mencapai ¾ bagian tabung, kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan critoseal. Tabung kapiler yang telah berisi darah kemudian diputar dengan sentrifuse pada 6000 rpm selama 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan membandingkan volume benda darah terhadap volume seluruh darah menggunakan skala hematokrit.

3.4.3 Eritrosit Total Blaxhall Daisley 1973

Penghitungan dilakukan dengan mengencerkan darah dengan larutan Hayem di dalam pipet pencampur berskala maksimum 101. Dalam pipet ini terdapat bulir berwarna merah yang berfungsi sebagai pengaduk. Darah dihisap dengan pipet pencampur hingga skala 0,5 lalu dengan pipet yang sama dihisap larutan Hayem hingga skala 101. Pipet kemudian digoyang membentuk angka delapan selama 3 - 5 menit agar darah tercampur secara merata. Sebelum dilakukan penghitungan, larutan pada bagian ujung pipet yang tidak teraduk dibuang, selanjutnya diteteskan ke dalam haemositometer dan ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop. Penghitungan dilakukan pada 10 kotak kecil haemositometer, Σ eritrosit = Σ eritrosit terhitung x 10 4 selmm 3 . 3.4.4 Leukosit Total Blaxhall Daisley 1973 Penghitungan dilakukan dengan mengencerkan darah dengan larutan Turks di dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Darah dicampur dengan pipet pencampur hingga skala 0,5 kemudian pipet yang sama dihisap larutan Turks hingga 11. Pipet kemudian digoyang membentuk angka delapan selama 3- 5 menit agar darah tercampur secara merata. Sebelum dilakukan penghitungan, larutan pada bagian ujung pipet yang tidak teraduk dibuang, tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam haemositometer dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop. Penghitungan dilakukan pada 16 kotak besar haemositometer, Σ leukosit = Σ leukosit terhitung x 50 selmm 3 .

3.4.5 Diferensial leukosit Amlacher 1970

Pengukuran diferensial leukosit sel darah putih dilakukan untuk mengetahui persentase tiap macam leukosit yang ada dalam darah. Penghitungan dilakukan dengan mengamati preparat ulas darah. Darah diteteskan diatas gelas objek yang bersih direndam metanol, kemudian ujung gelas objek kedua ditempatkan di atas gelas objek pertama hingga membentuk sudut 30 o . Gelas objek kedua digeser kearah belakang menyentuh tetesan darah hingga menyebar. Kemudian gelas objek kedua digeser kearah berlawanan hingga terbentuk lapisan tipis darah, dibiarkan hingga kering. Preparat difiksasi dengan methanol absolute selama 5 menit, kemudian diangkat dan dibiarkan kering udara. Pewarnaan preparat dilakukan selama 10 menit dalam wadah pewarnaan dengan larutan Giemsa, lalu diangkat dan dibilas dengan air mengalir dan dibiarkan kering udara. Preparat ulas darah kemudian ditempatkan di bawah mikroskop, diteteskan minyak imersi dan diamati dengan pembesaran 1000 kali. Kemudian dihitung jenis-jenis leukosit dan dihitung persentasenya. 3.4.6 Aktivitas Fagositik Anderson Siwicki 1993 Pengukuran indeks fagositik dilakukan dengan cara, sebanyak 50 µl sampel darah dimasukkan ke dalam eppendorf, ditambahkan 50 µ l suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS 10 8 selml. Sampel darah dihomogenkan dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Selanjutnya 5 µ l sampel darah dibuat sediaan ulas dan dikeringkan udarakan, kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit dan dikeringkan. Sediaan ulas direndam dalam pewarna Giemsa selama 15 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tissue. Selanjutnya dihitung jumlah sel yang menunjukkan proses fagositosis dari 100 sel fagosit yang teramati dengan rumus : Indeks Fagositik = Jumlah sel fagosit yang melakukan fagositosisjumlah sel fagosit x 100

3.4.7 Histopatologi

Pengukuran parameter histopatologi dilakukan pada organ kulit, hati, dan ginjal ikan lele dumbo pada hari ke 7 setelah uji tantang. Histopatologi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kerusakan organ akibat serangan bakteri patogen. Masing-masing perlakuan diambil 1 ekor ikan sebagai sampel. Hasil preparat histopatologi dibandingkan dengan kontrol. Jika terlihat tingkat kerusakan jaringan pada perlakuan lebih kecil dari kontrol berarti perlakuan memberikan pengaruh dalam menekan virulensi dari patogen. Prosedur pembuatan preparat histopatologi melalui empat tahapan yaitu : fiksasi atau pengawetan jaringan, perlakuan processing jaringan, pemotongan jaringan dan pewarnaan jaringan.

a. Fiksasi

Tahap permulaan pembuatan sediaan histopatologis adalah memotong bagian tubuh ikan yang akan dijadikan sampel, lalu kemudian dimasukkan dalam larutan fiksatif Bouin’s. Larutan Bouin’s dibuat dari campuran asam pikrat 21 gl, formalin 40 dan acetic acid glacial, dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Pada penelitian ini organ tubuh ikan yang diambil adalah kulit, ginjal, dan hati. Sampel dipotong dengan ukuran kira-kira 1x1 cm. Semua sampel organ direndam dalam larutan fiksatif Bouin’s selama 24 jam. Setelah difiksasi kemudian sampel direndam dalam larutan formalin 4 selama 24 jam dan alkohol 70 selama 24 jam, dengan tujuan agar sampel jaringan tidak mengeras.

b. Perlakuan processing jaringan

Potongan sampel organ diberi perlakuan berupa dehidrasi pengambilan air dan clearing penjernihan, kemudian dilakukan impregnasi penyusunan parafin untuk kemudian jaringan siap dibuat blok melalui proses embedding. Proses ini bertujuan untuk membuat sediaan ada dalam blok paraffin yang merupakan penunjang yang sangat diperlukan dalam proses pemotongan. Mula- mula paraffin cair dituang kedalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok. Sediaan diambil dengan pinset dan diletakkan diatas dasar blok tersebut, kemudiaan bahan embedding dituang hingga memenuhi cetakan dengan sediaan di dalamnya. Blok kemudian ditempel pada holder atau blok kayu.

c. Pemotongan jaringan

Sediaan yang sudah diblok siap dipotong dengan menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan dibuat preparat. Sebelum proes pewarnaan, dilakukan deparafinasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam Xylol I dan II masing- masing 5 menit dan dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam alkohol absolut I dan II selama 2-3 menit, alkohol 95 selama 2-3 menit, alkohol 90 selama 2-3 menit, alkohol 80 selama 2-3 menit, alkohol 70 selama 2-3 menit, alkohol 50 selama 2-3 menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi yaitu proses mencuci preparat jaringan dengan aquades mengalir selama 2-3 menit.

d. Pewarnaan jaringan