Waktu dan Lokasi Penelitian Alat dan Bahan Analisis Data

3. BAHAN DAN METODE

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April 2011 di Laboratorium Air PT. TIMAH, Tbk. Pangkalpinang, Bangka. Penelitian ini menggunakan air laut sampel yang berasal dari aktivitas hasil penambangan timah di Pantai Rebo, Kabupaten Bangka Induk, Provinsi Kepulauan Bangka Belitung. Secara rinci, referensi geografis tempat pengambilan sampel air laut adalah 01°55′22,2″ LS dan 106°10′30,9″ BT. Tempat pengambilan sampel air limbah logam berat hasil aktifitas penambangan timah di Pulau Bangka dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4. Peta lokasi pengambilan sampel air limbah logam berat di pulau Bangka

3.2. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian Alat dan Bahan Spesifikasi Jumlah Unit Aerator Air Pump AC-9902 4 Autoklaf - 1 Batu dan selang Aerasi - 9 Pipet Tetes - 12 Botol Gelas 1.5 L 12 Bulb Assistant 1 Bunsen - 1 Erlenmeyer Iwaki 100, 250, 750, dan 2800 mL 1 Gelas Beker Iwaki 1000 dan 2000 mL 1 Gelas Ukur Iwaki 50, 100, dan 500 mL 1 Haemacytometer Assistant Neubauer 25x10 -4 mm 2 1 Handcounter - 1 Hotplate Labinco L-32 1 Lampu Neon Philips 40 watt 3 Mikroskop Olympus 4×, 10×, 40×, 100× 1 Kertas pH Indikator Merck pH 1-14 1 Pipet Mohr Iwaki 1, 2, 10, dan 25 mL 1 Refraktometer Hand Refraktometer Atago 1 Thermometer Air Raksa Hg 1 Sprayer - 1 Tabung Durham Iwaki 15 mL 18 Timbangan Analitik AND EK-3000i 1 Air laut - 60 L Akuabides - 5 L Akuades - 100 L Alkohol 70 1000 L Aluminium Foil - 1 Bibit Nannochloropsis sp. - 250 mL Bibit Chlorella sp. - 250 mL KNO 3 Pekat - 100 mL NaOH Pekat - 100 mL Tisu - 5 gulung Kertas Saring Millipore Wheatman 150 Filtering Apparatus - 1 Ember 100 L - 2 Corong kaca - 1 Labu Ukur 100 mL 18 Inkubator Memmert 1 Jerigen 35 L 1 Botol Duran 500 mL 9

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Pengambilan Air Limbah di Daerah Penambangan Timah

Pengambilan sampel air laut dilakukan tanggal 6 Februari 2011, pukul 14:30 WIB dengan menggunakan perahu nelayan. Sampel air laut diambil menggunakan wadah polietilen berukuran 35 Liter.

3.3.2. Filterisasi

Filterisasi merupakan suatu metode yang dilakukan untuk menyaring air laut dengan tujuan menghilangkan partikel-partikel sedimentasi yang ada di dalam sampel tersebut. Metode ini menggunakan prinsip penyaringan dengan kertas Millipore. Penggunaan kertas saring dimaksudkan agar partikel-partikel suspensi dapat tersaring, sehingga yang terlarut akan menjadi media bagi kultivasi mikroalga. Alat yang digunakan dalam proses filterisasi ini adalah penyaring air laut. Bagian-bagiannya terdiri atas pompa vakum, gelas media tampungan sebagai wadah filtrat, selang silikon penghubung pompa vakum dengan gelas filtrat, dan kertas saring Millipore. Gambar 5. Alat penyaring sampel air laut Metode filterisasi tidak bertujuan untuk membunuh bakteri, karena hal tersebut bertujuan agar partikel yang berukuran lebih dari 0,45 µm akan tersaring, dan kurang dari 0,45 µm akan menjadi bagian partikel terlarut, termasuk ion atau logam-logam berat di dalamnya. Proses filterisasi dimulai dengan mengalirkan air limbah yang mengandung suspensi ke filtering apparatus, selanjutnya air filtrat yang tersaring akan digunakan sebagai media kultur yang sebelumnya akan melalui tahap sterilisasi autoclave agar air sampel limbah bebas dari patogen dan sel plankton lainnya yang memiliki ukuran sel kurang dari 0,45 µm.

3.3.3. Sterilisasi

Sterilisasi bertujuan untuk menyucihamakan alat serta bahan yang akan digunakan untuk isolasi maupun kultur mikroalga dari mikroorganisme serta bahan kimia yang dapat menjadi kontaminan Kawaroe, 2008. Metode sterilisasi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu melalui pemanasan sederhana air tawar untuk sterilisasi alat dan wadah dan menggunakan autoclave panas bertekanan untuk media air laut dan peralatan yang tahan panas lainnya. Pemanasan air tawar atau akuades digunakan untuk sterilisasi alat dan wadah kultur, terdiri atas: selang dan batu aerasi, pipet mohr 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; dan 25 mL, tabung reaksi, penutup tabung reaksi, dan erlenmeyer volume 2800 mL. Sterilisasi dimulai dengan pemanasan air tawar dengan menggunakan hot plate hingga mendidih. Wadah dan alat yang sebelumnya telah dicuci dan dibilas dengan air tawar, selanjutnya dialirkan air panas dari hot plate membunuh bakteri yang ada di wadah dan ditiriskan. Sterilisasi menggunakan autoclave merupakan suatu metode yang memanfaatkan uap panas bertekanan, dengan suhu hingga 126 o C, dan tekanan mencapai 1,5 atm. Metode ini digunakan untuk peralatan kultivasi dan air media, yang bertujuan untuk menghilangkan kontaminasi dari patogen yang ada di dalam media. Media autoclave dapat digunakan setiap pemakaian selama kurang-lebih 30 menit. Dengan luas penampang kira-kira 2 liter media.

3.3.4. Proses Kultur Nannochloropsis sp. dan Chlorella sp.

1 Persiapan Wadah Kultur Wadah kultur 250 mL, 750 mL, 1500 mL, dan 2800 mL yang telah disterilkan, baik menggunakan autoclave maupun pemanas disusun sesuai dengan kebutuhan pengkulturan. Wadah kultur terbagi menjadi dua, yaitu wadah bagi media Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. Wadah yang telah disiapkan diberi air laut sesuai dengan kapasitas masing-masing wadah. Tahap awal kultur dimulai dari media 250 mL, atau dari gelas erlenmeyer 250 mL. Selanjutnya, media 250 mL diberi pupuk Pro Analis. Dalam penelitian ini, wadah yang digunakan berisi pupuk dari media Conwy Walne’s media sebanyak 1 mL untuk 1000 mL air sampel. Setelah mencapai masa puncak populasi, media 250 mL dapat dikultur kembali dengan menggunakan media 2000 mL, dan selanjutnya media dapat digunakan untuk keperluan penelitian. Gambar 6. Autoclave 2 Persiapan Pupuk Conwy atau Walne Untuk Kultivasi Mikroalga Pupuk yang digunakan mengandung campuran dari beberapa bahan-bahan kimia yang berfungsi untuk memberikan nutrisi dalam mendukung pertumbuhan mikroalga. Tempat penyimpanan bahan-bahan kimia biasanya disediakan khusus agar tidak menimbulkan kontaminasi dengan benda-benda sekitarnya. Larutan media ini dicampurkan ke dalam wadah kultur sesuai dengan volume media kultur. Selanjutnya media tersebut dapat dihitung jumlah kepadatan sel secara rutin dengan menggunakan haemacytometer.

3.3.5. Perhitungan Kepadatan Sel Mikroalga

Perhitungan kepadatan bertujuan untuk menentukan kondisi mikroalga setiap harinya sel yang bertambah besar dan bertambah banyak. Perhitungan sel mikroalga menggunakan haemacytometer dan alat bantu handcounter untuk mencatat jumlah perhitungan. Haemacytometer terbuat dari gelas yang dibagi menjadi kotak-kotak pada dua tempat bidang pandang untuk menghitung jumlah kepadatan sel. Gambar 7. Haemacytometer Sumber: Isnansetyo 1995 Kotak tersebut berbentuk bujur sangkar dengan sisi 1 mm dan tinggi 0,1 mm, sehingga bila ditutup dengan cover glass, akan menghasilkan volume ruangan 0,1 mm 3 atau 10 -4 ml. Kotak tersebut dibagi lagi menjadi dua puluh lima kotak bujur sangkar, yang masing-masing dibagi lagi menjadi enam belas kotak bujur sangkar yang lebih kecil Isnansetyo, 1995. Contoh penghitungan kepadatan Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. dapat dilihat pada Lampiran 1. Estimasi kepadatan sel mikroalga dapat digambarkan dalam perhitungan pada persamaan 1 sebagai berikut: 1. Dalam 400 kotak bila kepadatan rendah Jumlah sel x 10 4 ml = N selmL …………………… 1 2. Dalam beberapa 80 kotak bila kepadatan terlalu tinggi Rata-rata jumlah sel dari 80 kotak x 400 x 10 4 ml = N selmL

3.3.6. Pengukuran Parameter Fisika dan Kimia Media Kultivasi Mikroalga

Pengukuran parameter ini bertujuan untuk menentukan pengaruh dari masing-masing parameter terhadap pertumbuhan dari mikroalga Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp.. Selain itu, pengukuran ini juga berperan penting dalam membandingkan pengaruh keadaan yang terkontrol dan fluktuatif terhadap kehidupan mikroalga. Pengukuran parameter dilakukan setiap hari dengan menggunakan thermometer untuk parameter suhu o C, Refraktometer untuk salinitas ‰, dan pH meter untuk parameter keasaman air sampel limbah dalam media kultivasi.

3.3.7. Pemanenan Populasi Mikroalga

Pemanenan dilakukan apabila hasil kultivasi telah mencapai tahap maksimum. Hal tersebut dikarenakan, masa pertumbuhan mikroalga Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. akan mengalami penurunan jumlah kepadatan fase drop atau kematian. Apabila pemanenan mikroalga terlalu cepat atau belum mencapai puncak populasi, sisa zat hara masih cukup besar sehingga dapat membahayakan organisme yang memanfaatkannya sebagai pakan alami. Pemanenan dilakukan agar diperoleh bibit awal yang sesuai dengan kualitas yang baik, dan selanjutnya dapat digunakan sebagai bibit kultur untuk perlakuan penelitian dengan media yang tecemar logam berat.

3.3.8. Pemindahan Populasi Kultur ke Dalam Media Limbah Logam Berat

Populasi mikroalga akan mencapai masa puncak populasi. Hal ini dimaksudkan kepadatan sel akan mencapai maksimum dan dapat digunakan untuk keperluan penelitian menggunakan media limbah logam berat dari air laut sampel. Selanjutnya populasi dari masing-masing jenis mikroalga Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. dikontakkan ke dalam media khusus yang tercemar logam. Jumlah sel ml sampel mikroalga yang dimasukkan ke dalam media sesuai dengan kepadatan sel yang diperoleh ketika mencapai puncak populasi. Ketepatan pemindahan jumlah sel dapat menggunakan formula pengenceran air media dengan sampel bibit mikroalga. Semakin tinggi kepadatan sel mikroalga, maka semakin sedikit inokulan sel yang ditambahkan. Pemindahan bibit inokulasi bibit sel Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. ke dalam wadah 1500 mL perlakuan pupuk dan 750 mL tanpa pupuk dihitung berdasarkan kepadatan Chlorella sp. dan Nannochoropsis dalam wadah inokulum. Dengan demikian, perhitungan dapat dimulai dengan menggunakan rumus pengenceran N 1 ×V 1 = N 2 ×V 2 . Volume awal Chlorella sp. yang diperoleh dari rumus pengenceran adalah sebesar 51 mL dalam media 1500 mL dan 25,575 mL dalam media 750 mL air sampel limbah untuk memperoleh kepadatan 1.000.000 selmL dalam media kultur dari limbah. Volume ini diperoleh dari jumlah sel Chlorella sp. sebesar 29.325.000 selmL. Berbeda hal nya sel Nannochloropsis sp. bervolume 35 ml untuk wadah media 1500 mL, dan 18,570 mL untuk media 750 mL, dengan jumlah kepadatan sel Nannochloropsis sp. sebesar 40.325.000 selmL. Volume air media air laut sampel yang dibutuhkan dalam proses pengkulturan diperoleh dari jumlah volume kultur media dikurangi volume bibit sel mikroalga yang dimasukkan ke dalam media. Dengan demikian, jumlah volume antara air laut sampel dengan bibit sel adalah 1500 mL untuk perlakuan menggunakan pupuk dan 750 mL tanpa menggunakan pupuk. Pada tahap akhir, dengan menggunakan rumus pengenceran, akan diperoleh jumlah kepadatan sel yang diharapkan untuk kultur awal, yaitu 1.000.000 selmL. Metode pemindahan bibit sel mikroalga ke dalam media limbah pada penelitian ini disajikan pada Gambar 8. Gambar 8. Pemindahan bibit sel mikroalga ke dalam media limbah 2000 ml Chlorella sp. 29.325.000 selmL 1450 ml air limbah . 1465 ml air limbah . Bibit sel mikroalga dalam media kultur non-limbah 2000 ml Nannochloropsis sp. 40.375.000 selmL 50 ml 35 ml Media limbah logam berat yang digunakan untuk kultur 1500 ml air limbah + sel Chlorella sp. 1500 ml air limbah + sel Nannochloropsis sp. Media Perlakuan Dengan demikian, kepadatan sel awal yang diperoleh dalam media air laut limbah 1500 mL dan 750 mL adalah 1.000.000 selmL. Selanjutnya akan dilakukan perhitungan harian, dimana jumlah sel diduga akan terus bertambah hingga mencapai masa puncak populasi sel dan dilakukan pemanenan serta perhitungan kapasitas ion logam berat yang diserap oleh mikroalga.

3.3.9. Perhitungan Laju Serapan Sel Mikroalga terhadap Logam Berat

Perhitungan laju serapan kapasitas bioabsorpsi ini dilakukan setelah populasi dari Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. mencapai masa puncaknya. Sehingga ion logam berat yang terserap dapat dihitung menggunakan AAS Spektrofotometer Serapan Atom yang diperoleh dari biomassa sampel air mikroalga yang sebelumnya telah dilakukan penyaringan dan pengasaman sampai proses pelarutan bahan organik, sehingga yang tersisa adalah bahan-bahan anorganik termasuk logam berat. Langkah awal yang dilakukan adalah menyiapkan sampel mikroalga Chlorella sp. dan Nannchloropsis sp. Selanjutnya sampel tersebut disaring menggunakan alat penyaring sampel air dan kertas saring Whatman bebas abu. Setelah disaring, hitung berat biomassa yang telah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60 - 80 o C. Setelah kering biomassa ditimbang menggunakan neraca analitik sebelumnya, kertas saring ditimbang terlebih dahulu untuk mengetahui berat kering dari kertas saring. Proses pelarutan melepaskan logam yang menempel pada mikroalga memerlukan asam kuat, yakni asam sulfat H 2 SO 4 98 dan asam nitrat pekat HNO 3 masing-masing sebanyak 5 ml. Proses berikutnya dilanjutkan di ruang pemanasan agar air sampel benar-benar bebas dari abu atau bahan-bahan organik lainnya. Proses pemanasan dilakukan selama kurang-lebih 3 jam hingga yang tersisa dari sampel hanya berupa bahan-bahan anorganik, termasuk logam-logam berat. Setelah dipanaskan, sampel diencerkan dengan menambahkan HCl ke dalam labu ukur ukuran 50 ml. Tahap akhir dari proses ini adalah analisis logam berat menggunakan AAS. Ion-ion logam berat yang diukur adalah logam Pb, Cu, Cd, dan Cr. Proses pelarutan biomassa mikroalga dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 9. Gambar 9. Diagram alir proses pelarutan biomassa mikroalga hingga analisis logam berat 100 mL air sampel sel Nannochloropsis sp. dan Chlorella sp. Penyaringan biomassa Dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 s.d. 80 C Hitung bobot kering biomassa Kertas saring bebas abu Wheatman Melarutkan biomassa dengan pelarut asam kuat Gelas beker 100 mL ditambahkan masing-masing 5 ml H 2 SO 4 dan HNO 3 Dipanaskan digest Sehingga bahan-bahan organik dalam media larut + 2-3 jam Pengenceran Menggunakan HCl dalam labu ukur 50 mL Analisis logam berat yang terserap Menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom tipe AA 7000 Lab. Produktifitas dan Lingkungan Perairan, MSP, FPIK. IPB. Lab. Kimia, FMIPA IPB.

3.4. Analisis Data

Analisis dilakukan dengan cara membandingkan laju pertumbuhan spesifik µ, serta serapan logam berat dari spesies Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. Perbandingan tersebut digambarkan dengan menggunakan grafik, laju pertumbuhan spesifik µ, dan kapasitas bioabsorpsi mg logam beratg biomassa Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp.. Kualitas air dianalisis menggunakan uji validitas Pearson untuk melihat korelasi yang terjadi dan uji lanjut regresi untuk melihat pengaruh parameter kualitas air terhadap kelimpahan dengan nilai p=0,05. Laju pertumbuhan spesifik µ mikroalga dihitung dengan formula menurut Krichnavaruk et al. 2004, pada persamaan 2. Contoh penghitungan dapat dilihat pada lampiran 2. µ = ………………………………. 2 keterangan : N t = Kepadatan populasi pada waktu ke-t, N o = Kepadatan populasi sel pada waktu ke-0; T o = Waktu awal; T t = Waktu pengamatan. Kapasitas bioabsorpsi mikroalga q e dihitung menurut model adsorpsi isothermal dengan rumus menurut Vijayaraghavan, et al. 2004 pada persamaan 3. Contoh penghitungan dapat dilihat pada Lampiran 3. W V C C q e i e − = .................................... 3 Keterangan : q e = Kapasitas bioabsorpsi mg Pb, Cd, Cr, Cu g biomassa mikroalga mgg; V = Volume larutan dalam wadah gelas atau erlenmeyer dengan kontak batch ml; C i = Konsentrasi ion Pb, Cd, Cr, Cu dalam larutan mgl; C e = Konsentrasi akhir atau keseimbangan ion Pb, Cd, Cr, Cu dalam larutan mgl, W adalah massa sel g.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Kepadatan dan Laju Pertumbuhan Spesifik Chlorella sp.

Penelitian ini mendapati bahwa mikroalga Chlorella sp. memiliki laju pertumbuhan spesifik dan kepadatan yang cukup baik untuk setiap perlakuan. Laju pertumbuhan spesifik dan kepadatan sel Chlorella sp. dapat dilihat pada Lampiran 5 dan grafik kepadatan sel Chlorella sp. dapat dilihat pada Gambar 10. Jumlah kepadatan sel Chlorella sp. dengan perlakuan limbah logam berat pada awal kultivasi adalah 1,00×10 6 selmL. Pertumbuhan masa puncak populasi Chlorella sp. terjadi pada hari ke-10 dengan jumlah sel mencapai 16,72×10 6 selmL. Gambar 10. Grafik kepadatan sel Chlorella sp. Sel Chlorella sp. memiliki jumlah kepadatan sel dan laju pertumbuhan spesifik yang berbeda tiap perlakuan. Kepadatan Chlorella sp. tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol, sedangkan kepadatan sel terendah terdapat pada perlakuan tanpa pupuk. Puncak kepadatan populasi sel Chlorella sp. dengan 5 10 15 20 25 30 35 1 3 5 7 9 11 13 15 K ep a d a ta n s el 1 6 se l m l Hari ke- Kontrol Pupuk Tanpa Pupuk