3. BAHAN DAN METODE
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April 2011 di Laboratorium Air PT. TIMAH, Tbk. Pangkalpinang, Bangka. Penelitian ini
menggunakan air laut sampel yang berasal dari aktivitas hasil penambangan timah di Pantai Rebo, Kabupaten Bangka Induk, Provinsi Kepulauan Bangka Belitung.
Secara rinci, referensi geografis tempat pengambilan sampel air laut adalah 01°55′22,2″ LS dan 106°10′30,9″ BT. Tempat pengambilan sampel air limbah
logam berat hasil aktifitas penambangan timah di Pulau Bangka dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Peta lokasi pengambilan sampel air limbah logam berat di pulau Bangka
3.2. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian
Alat dan Bahan Spesifikasi
Jumlah Unit Aerator
Air Pump AC-9902 4
Autoklaf -
1 Batu dan selang Aerasi
- 9
Pipet Tetes -
12 Botol Gelas
1.5 L 12
Bulb Assistant
1 Bunsen
- 1
Erlenmeyer Iwaki 100, 250, 750, dan 2800 mL
1 Gelas Beker
Iwaki 1000 dan 2000 mL 1
Gelas Ukur Iwaki 50, 100, dan 500 mL
1 Haemacytometer
Assistant Neubauer 25x10
-4
mm
2
1 Handcounter
- 1
Hotplate Labinco L-32
1 Lampu Neon
Philips 40 watt 3
Mikroskop Olympus 4×, 10×, 40×, 100×
1 Kertas pH Indikator
Merck pH 1-14 1
Pipet Mohr Iwaki 1, 2, 10, dan 25 mL
1 Refraktometer
Hand Refraktometer Atago 1
Thermometer Air Raksa Hg
1 Sprayer
- 1
Tabung Durham Iwaki 15 mL
18 Timbangan Analitik
AND EK-3000i 1
Air laut -
60 L Akuabides
- 5 L
Akuades -
100 L Alkohol
70 1000 L
Aluminium Foil -
1 Bibit Nannochloropsis sp. -
250 mL Bibit Chlorella sp.
- 250 mL
KNO
3
Pekat -
100 mL NaOH Pekat
- 100 mL
Tisu -
5 gulung Kertas Saring Millipore
Wheatman 150
Filtering Apparatus -
1 Ember 100 L
- 2
Corong kaca -
1 Labu Ukur
100 mL 18
Inkubator Memmert
1 Jerigen
35 L 1
Botol Duran 500 mL
9
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Pengambilan Air Limbah di Daerah Penambangan Timah
Pengambilan sampel air laut dilakukan tanggal 6 Februari 2011, pukul 14:30 WIB dengan menggunakan perahu nelayan. Sampel air laut diambil
menggunakan wadah polietilen berukuran 35 Liter.
3.3.2. Filterisasi
Filterisasi merupakan suatu metode yang dilakukan untuk menyaring air laut dengan tujuan menghilangkan partikel-partikel sedimentasi yang ada di dalam
sampel tersebut. Metode ini menggunakan prinsip penyaringan dengan kertas Millipore. Penggunaan kertas saring dimaksudkan agar partikel-partikel suspensi
dapat tersaring, sehingga yang terlarut akan menjadi media bagi kultivasi mikroalga.
Alat yang digunakan dalam proses filterisasi ini adalah penyaring air laut. Bagian-bagiannya terdiri atas pompa vakum, gelas media tampungan sebagai
wadah filtrat, selang silikon penghubung pompa vakum dengan gelas filtrat, dan kertas saring Millipore.
Gambar 5. Alat penyaring sampel air laut
Metode filterisasi tidak bertujuan untuk membunuh bakteri, karena hal tersebut bertujuan agar partikel yang berukuran lebih dari 0,45 µm akan tersaring,
dan kurang dari 0,45 µm akan menjadi bagian partikel terlarut, termasuk ion atau logam-logam berat di dalamnya. Proses filterisasi dimulai dengan mengalirkan
air limbah yang mengandung suspensi ke filtering apparatus, selanjutnya air filtrat yang tersaring akan digunakan sebagai media kultur yang sebelumnya
akan melalui tahap sterilisasi autoclave agar air sampel limbah bebas dari patogen dan sel plankton lainnya yang memiliki ukuran sel kurang dari 0,45 µm.
3.3.3. Sterilisasi
Sterilisasi bertujuan untuk menyucihamakan alat serta bahan yang akan digunakan untuk isolasi maupun kultur mikroalga dari mikroorganisme serta
bahan kimia yang dapat menjadi kontaminan Kawaroe, 2008. Metode sterilisasi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu melalui pemanasan sederhana air tawar
untuk sterilisasi alat dan wadah dan menggunakan autoclave panas bertekanan untuk media air laut dan peralatan yang tahan panas lainnya.
Pemanasan air tawar atau akuades digunakan untuk sterilisasi alat dan wadah kultur, terdiri atas: selang dan batu aerasi, pipet mohr 1 mL; 2 mL; 5 mL;
10 mL; dan 25 mL, tabung reaksi, penutup tabung reaksi, dan erlenmeyer volume 2800 mL. Sterilisasi dimulai dengan pemanasan air tawar dengan menggunakan
hot plate hingga mendidih. Wadah dan alat yang sebelumnya telah dicuci dan dibilas dengan air tawar, selanjutnya dialirkan air panas dari hot plate membunuh
bakteri yang ada di wadah dan ditiriskan. Sterilisasi menggunakan autoclave merupakan suatu metode yang memanfaatkan uap panas bertekanan, dengan suhu
hingga 126
o
C, dan tekanan mencapai 1,5 atm.
Metode ini digunakan untuk peralatan kultivasi dan air media, yang bertujuan untuk menghilangkan kontaminasi dari patogen yang ada di dalam
media. Media autoclave dapat digunakan setiap pemakaian selama kurang-lebih 30 menit. Dengan luas penampang kira-kira 2 liter media.
3.3.4. Proses Kultur Nannochloropsis sp. dan Chlorella sp.
1 Persiapan Wadah Kultur
Wadah kultur 250 mL, 750 mL, 1500 mL, dan 2800 mL yang telah disterilkan, baik menggunakan autoclave maupun pemanas disusun sesuai dengan
kebutuhan pengkulturan. Wadah kultur terbagi menjadi dua, yaitu wadah bagi media Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. Wadah yang telah disiapkan diberi
air laut sesuai dengan kapasitas masing-masing wadah. Tahap awal kultur dimulai dari media 250 mL, atau dari gelas erlenmeyer 250 mL. Selanjutnya, media 250
mL diberi pupuk Pro Analis. Dalam penelitian ini, wadah yang digunakan berisi pupuk dari media Conwy Walne’s media sebanyak 1 mL untuk 1000 mL air
sampel. Setelah mencapai masa puncak populasi, media 250 mL dapat dikultur kembali dengan menggunakan media 2000 mL, dan selanjutnya media dapat
digunakan untuk keperluan penelitian. Gambar 6. Autoclave
2 Persiapan Pupuk Conwy atau Walne Untuk Kultivasi Mikroalga
Pupuk yang digunakan mengandung campuran dari beberapa bahan-bahan kimia yang berfungsi untuk memberikan nutrisi dalam mendukung pertumbuhan
mikroalga. Tempat penyimpanan bahan-bahan kimia biasanya disediakan khusus agar tidak menimbulkan kontaminasi dengan benda-benda sekitarnya. Larutan
media ini dicampurkan ke dalam wadah kultur sesuai dengan volume media kultur. Selanjutnya media tersebut dapat dihitung jumlah kepadatan sel secara
rutin dengan menggunakan haemacytometer.
3.3.5. Perhitungan Kepadatan Sel Mikroalga
Perhitungan kepadatan bertujuan untuk menentukan kondisi mikroalga setiap harinya sel yang bertambah besar dan bertambah banyak. Perhitungan sel
mikroalga menggunakan haemacytometer dan alat bantu handcounter untuk mencatat jumlah perhitungan. Haemacytometer terbuat dari gelas yang dibagi
menjadi kotak-kotak pada dua tempat bidang pandang untuk menghitung jumlah kepadatan sel.
Gambar 7. Haemacytometer Sumber: Isnansetyo 1995
Kotak tersebut berbentuk bujur sangkar dengan sisi 1 mm dan tinggi 0,1 mm, sehingga bila ditutup dengan cover glass, akan menghasilkan volume
ruangan 0,1 mm
3
atau 10
-4
ml. Kotak tersebut dibagi lagi menjadi dua puluh lima kotak bujur sangkar, yang masing-masing dibagi lagi menjadi enam belas kotak
bujur sangkar yang lebih kecil Isnansetyo, 1995. Contoh penghitungan kepadatan Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. dapat dilihat pada Lampiran 1.
Estimasi kepadatan sel mikroalga dapat digambarkan dalam perhitungan pada persamaan 1 sebagai berikut:
1. Dalam 400 kotak bila kepadatan rendah
Jumlah sel x 10
4
ml = N selmL ……………………
1
2. Dalam beberapa 80 kotak bila kepadatan terlalu tinggi
Rata-rata jumlah sel dari 80 kotak x 400 x 10
4
ml = N selmL
3.3.6. Pengukuran Parameter Fisika dan Kimia Media Kultivasi Mikroalga
Pengukuran parameter ini bertujuan untuk menentukan pengaruh dari masing-masing parameter terhadap pertumbuhan dari mikroalga Chlorella sp.
dan Nannochloropsis sp.. Selain itu, pengukuran ini juga berperan penting dalam membandingkan pengaruh keadaan yang terkontrol dan fluktuatif terhadap
kehidupan mikroalga. Pengukuran parameter dilakukan setiap hari dengan menggunakan thermometer untuk parameter suhu
o
C, Refraktometer untuk salinitas ‰, dan pH meter untuk parameter keasaman air sampel limbah dalam
media kultivasi.
3.3.7. Pemanenan Populasi Mikroalga
Pemanenan dilakukan apabila hasil kultivasi telah mencapai tahap maksimum. Hal tersebut dikarenakan, masa pertumbuhan mikroalga Chlorella sp.
dan Nannochloropsis sp. akan mengalami penurunan jumlah kepadatan fase drop
atau kematian. Apabila pemanenan mikroalga terlalu cepat atau belum mencapai puncak populasi, sisa zat hara masih cukup besar sehingga dapat membahayakan
organisme yang memanfaatkannya sebagai pakan alami. Pemanenan dilakukan agar diperoleh bibit awal yang sesuai dengan kualitas yang baik, dan selanjutnya
dapat digunakan sebagai bibit kultur untuk perlakuan penelitian dengan media yang tecemar logam berat.
3.3.8. Pemindahan Populasi Kultur ke Dalam Media Limbah Logam Berat
Populasi mikroalga akan mencapai masa puncak populasi. Hal ini dimaksudkan kepadatan sel akan mencapai maksimum dan dapat digunakan untuk
keperluan penelitian menggunakan media limbah logam berat dari air laut sampel. Selanjutnya populasi dari masing-masing jenis mikroalga Chlorella sp. dan
Nannochloropsis sp. dikontakkan ke dalam media khusus yang tercemar logam. Jumlah sel ml sampel mikroalga yang dimasukkan ke dalam media sesuai
dengan kepadatan sel yang diperoleh ketika mencapai puncak populasi. Ketepatan pemindahan jumlah sel dapat menggunakan formula pengenceran air
media dengan sampel bibit mikroalga. Semakin tinggi kepadatan sel mikroalga, maka semakin sedikit inokulan sel yang ditambahkan.
Pemindahan bibit inokulasi bibit sel Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. ke dalam wadah 1500 mL perlakuan pupuk dan 750 mL tanpa pupuk
dihitung berdasarkan kepadatan Chlorella sp. dan Nannochoropsis dalam wadah inokulum. Dengan demikian, perhitungan dapat dimulai dengan menggunakan
rumus pengenceran N
1
×V
1
= N
2
×V
2
. Volume awal Chlorella sp. yang diperoleh dari rumus pengenceran adalah sebesar 51 mL dalam media 1500 mL dan 25,575
mL dalam media 750 mL air sampel limbah untuk memperoleh kepadatan
1.000.000 selmL dalam media kultur dari limbah. Volume ini diperoleh dari jumlah sel Chlorella sp. sebesar 29.325.000 selmL. Berbeda hal nya sel
Nannochloropsis sp. bervolume 35 ml untuk wadah media 1500 mL, dan 18,570 mL untuk media 750 mL, dengan jumlah kepadatan sel Nannochloropsis sp.
sebesar 40.325.000 selmL. Volume air media air laut sampel yang dibutuhkan dalam proses
pengkulturan diperoleh dari jumlah volume kultur media dikurangi volume bibit sel mikroalga yang dimasukkan ke dalam media. Dengan demikian, jumlah
volume antara air laut sampel dengan bibit sel adalah 1500 mL untuk perlakuan menggunakan pupuk dan 750 mL tanpa menggunakan pupuk. Pada tahap akhir,
dengan menggunakan rumus pengenceran, akan diperoleh jumlah kepadatan sel yang diharapkan untuk kultur awal, yaitu 1.000.000 selmL. Metode pemindahan
bibit sel mikroalga ke dalam media limbah pada penelitian ini disajikan pada Gambar 8.
Gambar 8. Pemindahan bibit sel mikroalga ke dalam media limbah
2000 ml
Chlorella sp.
29.325.000 selmL
1450 ml air limbah
.
1465 ml air limbah
.
Bibit sel mikroalga dalam media kultur non-limbah
2000 ml
Nannochloropsis sp.
40.375.000 selmL
50 ml 35 ml
Media limbah logam berat yang digunakan untuk kultur
1500 ml
air limbah
+
sel Chlorella sp.
1500 ml
air limbah + sel
Nannochloropsis sp.
Media Perlakuan
Dengan demikian, kepadatan sel awal yang diperoleh dalam media air laut limbah 1500 mL dan 750 mL adalah 1.000.000 selmL. Selanjutnya akan
dilakukan perhitungan harian, dimana jumlah sel diduga akan terus bertambah hingga mencapai masa puncak populasi sel dan dilakukan pemanenan serta
perhitungan kapasitas ion logam berat yang diserap oleh mikroalga.
3.3.9. Perhitungan Laju Serapan Sel Mikroalga terhadap Logam Berat
Perhitungan laju serapan kapasitas bioabsorpsi ini dilakukan setelah populasi dari Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp. mencapai masa puncaknya.
Sehingga ion logam berat yang terserap dapat dihitung menggunakan AAS Spektrofotometer Serapan Atom yang diperoleh dari biomassa sampel air
mikroalga yang sebelumnya telah dilakukan penyaringan dan pengasaman sampai proses pelarutan bahan organik, sehingga yang tersisa adalah bahan-bahan
anorganik termasuk logam berat. Langkah awal yang dilakukan adalah menyiapkan sampel mikroalga
Chlorella sp. dan Nannchloropsis sp. Selanjutnya sampel tersebut disaring menggunakan alat penyaring sampel air dan kertas saring Whatman bebas abu.
Setelah disaring, hitung berat biomassa yang telah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60 - 80
o
C. Setelah kering biomassa ditimbang menggunakan neraca analitik sebelumnya, kertas saring ditimbang terlebih
dahulu untuk mengetahui berat kering dari kertas saring. Proses pelarutan melepaskan logam yang menempel pada mikroalga
memerlukan asam kuat, yakni asam sulfat H
2
SO
4
98 dan asam nitrat pekat HNO
3
masing-masing sebanyak 5 ml. Proses berikutnya dilanjutkan di ruang pemanasan agar air sampel benar-benar bebas dari abu atau bahan-bahan organik
lainnya. Proses pemanasan dilakukan selama kurang-lebih 3 jam hingga yang tersisa dari sampel hanya berupa bahan-bahan anorganik, termasuk logam-logam
berat. Setelah dipanaskan, sampel diencerkan dengan menambahkan HCl ke dalam labu ukur ukuran 50 ml. Tahap akhir dari proses ini adalah analisis logam
berat menggunakan AAS. Ion-ion logam berat yang diukur adalah logam Pb, Cu, Cd, dan Cr. Proses pelarutan biomassa mikroalga dalam penelitian ini dapat
dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Diagram alir proses pelarutan biomassa mikroalga hingga analisis logam berat
100 mL air sampel sel Nannochloropsis sp. dan Chlorella sp.
Penyaringan biomassa
Dikeringkan menggunakan oven pada
suhu 60 s.d. 80 C
Hitung bobot kering biomassa
Kertas saring bebas abu Wheatman
Melarutkan biomassa
dengan pelarut asam kuat
Gelas beker 100 mL ditambahkan masing-masing
5 ml H
2
SO
4
dan HNO
3
Dipanaskan digest
Sehingga bahan-bahan organik dalam media larut
+ 2-3 jam Pengenceran
Menggunakan HCl dalam labu ukur 50 mL
Analisis logam berat yang
terserap Menggunakan
Spektrofotometer Serapan Atom
tipe AA 7000 Lab.
Produktifitas dan
Lingkungan Perairan,
MSP, FPIK. IPB.
Lab. Kimia,
FMIPA IPB.
3.4. Analisis Data
Analisis dilakukan dengan cara membandingkan laju pertumbuhan spesifik µ, serta serapan logam berat dari spesies Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp.
Perbandingan tersebut digambarkan dengan menggunakan grafik, laju pertumbuhan spesifik µ, dan kapasitas bioabsorpsi mg logam beratg biomassa
Chlorella sp. dan Nannochloropsis sp.. Kualitas air dianalisis menggunakan uji validitas Pearson untuk melihat korelasi yang terjadi dan uji lanjut regresi untuk
melihat pengaruh parameter kualitas air terhadap kelimpahan dengan nilai p=0,05. Laju pertumbuhan spesifik µ mikroalga dihitung dengan formula menurut
Krichnavaruk et al. 2004, pada persamaan 2. Contoh penghitungan dapat dilihat pada lampiran 2.
µ =
……………………………….
2 keterangan :
N
t
= Kepadatan populasi pada waktu ke-t,
N
o
= Kepadatan populasi sel pada waktu ke-0;
T
o
= Waktu awal;
T
t
= Waktu pengamatan.
Kapasitas bioabsorpsi mikroalga q
e
dihitung menurut model adsorpsi isothermal dengan rumus menurut Vijayaraghavan, et al. 2004 pada persamaan
3. Contoh penghitungan dapat dilihat pada Lampiran 3.
W V
C C
q
e i
e
− =
.................................... 3
Keterangan : q
e
= Kapasitas bioabsorpsi mg Pb, Cd, Cr, Cu g biomassa
mikroalga mgg; V
= Volume larutan dalam wadah gelas atau erlenmeyer dengan kontak
batch ml; C
i
= Konsentrasi ion Pb, Cd, Cr, Cu dalam larutan mgl;
C
e
= Konsentrasi akhir atau keseimbangan ion Pb, Cd, Cr, Cu dalam
larutan mgl, W adalah massa sel g.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Kepadatan dan Laju Pertumbuhan Spesifik Chlorella sp.
Penelitian ini mendapati bahwa mikroalga Chlorella sp. memiliki laju pertumbuhan spesifik dan kepadatan yang cukup baik untuk setiap perlakuan.
Laju pertumbuhan spesifik dan kepadatan sel Chlorella sp. dapat dilihat pada Lampiran 5 dan grafik kepadatan sel Chlorella sp. dapat dilihat pada Gambar 10.
Jumlah kepadatan sel Chlorella sp. dengan perlakuan limbah logam berat pada awal kultivasi adalah 1,00×10
6
selmL. Pertumbuhan masa puncak populasi Chlorella sp. terjadi pada hari ke-10 dengan jumlah sel mencapai 16,72×10
6
selmL.
Gambar 10. Grafik kepadatan sel Chlorella sp. Sel Chlorella sp. memiliki jumlah kepadatan sel dan laju pertumbuhan
spesifik yang berbeda tiap perlakuan. Kepadatan Chlorella sp. tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol, sedangkan kepadatan sel terendah terdapat pada
perlakuan tanpa pupuk. Puncak kepadatan populasi sel Chlorella sp. dengan
5 10
15 20
25 30
35
1 3
5 7
9 11
13 15
K ep
a d
a ta
n s
el 1
6
se l
m l
Hari ke-
Kontrol Pupuk
Tanpa Pupuk