22
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan eksperimental murni.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas. Suhu pencampuran 30
o
C dan 70
o
C dan lama pencampuran 5 menit dan 15 menit.
b. Variabel tergantung. 1 Uji iritasi primer : eritema dan edema
2 Uji pH : pH sediaan 3 Uji sifat fisik : daya sebar dan viskositas
4 Stabilitas fisik : pergeseran viskositas 5 Uji daya antibakteri : diameter zona hambat terhadap S. epidermidis.
c. Variabel pengacau terkendali. Umur dan makanan hewan uji uji iritasi primer; kecepatan pencampuran,
lama penyimpanan, wadah penyimpanan, penggunaan alat uji yang sama; kepadatan suspensi bakteri S. epidermidis, diameter lubang sumuran, suhu
inkubasi, lama inkubasi uji daya antibakteri. d. Variabel pengacau tak terkendali. Kondisi patofisiologis hewan uji uji
iritasi primer; suhu saat penyimpanan dan laju penguapan minyak cengkeh.
2. Definisi Operasional
a. Minyak cengkeh adalah minyak essensial yang berasal dari daun tanaman
cengkeh Eugenia caryophyllata Thunb., diperoleh dari CV Indaroma
Yogyakarta CoA terlampir. b.
Emulgel minyak cengkeh adalah sediaan topikal semisolid hasil
emulsifikasi minyak cengkeh daun dengan emulsifying agent Tween 80 dan Span 80 yang dicampurkan dengan gelling agent carbopol 940 sesuai
dengan formula dalam penelitian ini. c.
Emulsifying agent adalah bahan yang dapat mengurangi tegangan antar
muka antara minyak dan air, menurunkan gaya tolak antar cairan, dan membentuk lapisan film yang mencegah kontak antar droplet sehingga
mencegah koalesensi. Pada penelitian ini digunakan Tween 80 dan Span 80. d.
Pencampuran adalah proses pendistribusian bahan satu ke bahan lain
hingga tercapai homogenitas yaitu saat proses emulsifikasi dan saat
penambahan gelling agent. e.
Suhu pencampuran adalah suhu yang digunakan saat proses emulsifikasi. f.
Lama pencampuran adalah lama atau waktu yang digunakan saat proses emulsifikasi dan penambahan gelling agent.
g. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahannya dan dapat
dikuantitatifkan. Respon penelitian ini adalah sifat fisik dan stabilitas fisik
emulgel. h.
Iritasi primer adalah proses peradangan yang mungkin terjadi sesudah
pengaplikasian sediaan topikal pada kulit punggung kelinci yang dapat
ditunjukkan dengan adanya eritema dan edema. Eritema adalah kemerahan pada kulit yang disebabkan pelebaran pembuluh kapiler yang bersifat
reversible. Edema adalah pembengkakan yang dapat diamati disebabkan
karena akumulasi cairan yang berlebihan dalam jaringan tubuh. i.
Sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel adalah parameter yang digunakan
untuk mengetahui kualitas fisik daya sebar dan viskositas dan stabilitas
fisik pergeseran viskositas selama penyimpanan 1 bulan emulgel. j.
Daya sebar adalah kemampuan penyebaran sediaan emulgel diatas kaca
bulat berskala setelah diberikan beban berupa kaca bulat berskala yang diketahui beratnya 50 gram, diameter penyebaran dicatat dalam satuan cm
dengan mengambil rata-rata dari 4 sisi pengukuran. k.
Viskositas adalah tahanan sediaan untuk mengalir, diukur dengan viscotester seri VT 04 RION-JAPAN dengan mengamati jarum penunjuk.
l. Pergeseran viskositas adalah perubahan nilai viskositas dari 48 jam ke 1
bulan setelah sediaan emulgel dibuat. m.
S. epidermidis adalah kultur murni bakteri uji Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 yang diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta. n.
Daya antibakteri emulgel adalah kemampuan emulgel minyak cengkeh
dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri S. epidermidis setelah diinkubasi 48 jam, ditunjukkan oleh diameter zona hambat yang
dihasilkan.
o. Potensi adalah kemampuan antibakteri sediaan emulgel minyak cengkeh
dibandingkan terhadap kontrol negatif yaitu basis emulgel. p.
Zona hambat adalah zona jernih yang tidak ada pertumbuhan S.
epidermidis atau pertumbuhan S. epidermidis terhambat dibandingkan
dengan kontrol pertumbuhan bakteri.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak cengkeh dari daun tanaman cengkeh Eugenia caryophyllata Thunb. yang diperoleh dari CV
Indaroma Yogyakarta, Carbopol 940, gliserin, Tween 80, Span 80, parafin cair, trietanolamin TEA dengan kualitas farmasetis, media Muller-Hinton Agar
MHA, media Muller-Hinton Broth MHB, bakteri uji S. epidermidis yang diperoleh dari Balai Laboratorim Kesehatan Yogyakarta dan telah diuji
kemurniannya Lampiran 2, dan aquades dari Laboratorium Kimia Analisis Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas Pyrex- Germany, timbangan analitik METTLER TOLEDO GB 3002 Switzerland,
waterbath Tamson Zoetermeer-Holand 1985 0023, termometer, mixer merk Maspion modifikasi Elecsa Elektro Sanata Dharma, cawan petri, viscotester seri
VT 04 RION-JAPAN, stopwatch, kaca bulat berskala, jarum ose, alat pelubang sumuran, autoklaf, inkubator.
E. Tata Cara Penelitian
1. Identifikasi bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : a. Minyak cengkeh yang merupakan minyak essensial dari daun tanaman
cengkeh Eugenia caryophyllata Thunb. diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta dan telah diuji identitasnya, dibuktikan dengan Certificate of
Analysis Lampiran 1. Identifikasi yang dilakukan berupa pengamatan
organoleptis meliputi bau dan warna.
b. Kultur murni bakteri uji S. epidermidis ATCC 12228 yang diperoleh dari Balai Laboratorim Kesehatan Yogyakarta dan telah diuji kemurniannya
Lampiran 2. 2.
Verifikasi sifat fisik minyak cengkeh Verifikasi minyak cengkeh yang dilakukan dalam penelitian adalah :
a. Verifikasi indeks bias minyak cengkeh. Indeks bias minyak cengkeh diukur menggunakan refractometer ABBE. Refractometer ABBE dialirin air sesuai
dengan suhu yang diinginkan. Minyak cengkeh diteteskan pada prisma utama, kemudian prisma ditutup dan refraktometer diarahkan ke sumber
cahaya terang, sehingga melalui lensa skala dapat dilihat dengan jelas. Nilai indeks bias minyak cengkeh ditunjukkan oleh garis batas yang memisahkan
sisi terang dan sisi gelap pada bagian atas dan bawah. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b. Verifikasi bobot jenis minyak cengkeh. Bobot jenis minyak cengkeh diukur dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi, dengan
menetapkan bobot piknometer kosong dan bobot air pada suhu 25
o
C. Piknometer tersebut lalu diisi dengan minyak cengkeh dan suhu
dikondisikan hingga 25
o
C, kemudian pipa kapiler piknometer ditutup, piknometer ditimbang setelah didiamkan sampai mencapai suhu ruangan.
Bobot piknometer yang telah diisi minyak cengkeh dikurangi dengan bobot piknometer kosong. Bobot jenis minyak cengkeh merupakan perbandingan
antara bobot minyak cengkeh dengan bobot air dalam piknometer pada suhu 25
o
C. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
3. Pembuatan emulgel minyak cengkeh
Formula yang digunakan adalah : R Minyak cengkeh
15,0 g Carbopol 940
2,0 g Trietanolamin
0,6 g Liquid parafin
1,0 g Tween 80
17,5 g Span 80
2,5 g Gliserin
2,0 g Metil paraben
0,18 g Propil paraben
0,02 g Aquades
54,2 g
Tabel VI. Variasi suhu pencampuran dan lama pencampuran emulgel minyak cengkeh
Formula Suhu pencampuran
o
C Lama pencampuran menit
1 30
5 2
70 5
3 30
15 4
70 15
Cara pembuatan emulgel minyak cengkeh :
Carbopol 940 dikembangkan dengan menggunakan sebagian aquades dari formula selama 24 jam, kemudian semua bahan yang termasuk fase
minyak minyak cengkeh, parafin cair, propil paraben, dan span 80 dicampur
pada suhu 30 atau 70
o
C, semua bahan yang termasuk fase air aquades, tween
80, metil paraben, dan gliserin dicampur pada suhu 30 atau 70
o
C dengan
kecepatan putar 350 rpm rotation per minute. Campuran fase minyak ditambahkan ke dalam campuran fase air dengan kecepatan putar 350 rpm.
Pencampuran emulsi tersebut dilakukan selama 5 atau 15 menit pada suhu 30 atau 70
o
C. Emulsi selanjutnya dicampurkan ke dalam carbopol 940 yang
sebelumnya telah dikembangkan dengan aquades menggunakan mixer dengan kecepatan putar 350 rpm selama 5 atau 15 menit pada suhu ruangan.
Trietanolamin ditambahkan dan pengadukkan dilanjutkan selama 5 menit.
4. Uji pH
Indikator universal bentuk kertas dicelupkan ke dalam sediaan emulgel minyak cengkeh yang hendak ditentukan pH-nya. Warna yang
terbentuk kemudian dicocokkan atau dibandingkan dengan warna standar yang sudah diketahui nilai pH-nya.
5. Uji iritasi primer
Bulu bagian punggung kelinci dicukur kemudian dibagi menjadi 2 sisi kiri dan kanan untuk sediaan emulgel dan basis emulgel sebagai kontrol
dengan area berukuran kira-kira 1 inci x 1 inci 2,54 cm x 2,54 cm di masing- masing sisi. Setiap formula yang akan diuji dan basis ditimbang 0,5 gram,
kemudian diaplikasikan ke kulit kelinci. Bagian kulit kelinci ditutup dan dibungkus dengan kain kasa. Kelinci tersebut dikembalikan ke kandang. Hasil
uji diamati pada 24, 48, dan 72 jam setelah perlakuan. Setelah 24 jam sediaan
emulgel dan basis dihilangkan, sisi perlakuan dibersihkan dengan air untuk menghilangkan residu. Kriteria uji iritasi primer mengacu pada Tabel III.
6. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik sediaan emulgel minyak cengkeh
Sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel minyak cengkeh yang diuji pada
penelitian ini meliputi :
a. Uji daya sebar. Satu gram sediaan diletakkan di tengah dua lempengan kaca bulat berskala. Di atas sediaan diletakkan kaca bulat lain dengan berat 50
gram, didiamkan selama 1
menit. Kemudian dicatat diameter
penyebarannya. Pengujian dilakukan 1 kali yaitu 48 jam setelah sediaan selesai dibuat.
b. Uji viskositas. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan Viscometer Rion seri VT 04. Alat disiapkan dan dipasang pada rotornya lalu
diatur supaya jarum penunjuk tepat. Sediaan dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viscotester dihidupkan dan
viskositas sediaan diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Pengujian dilakukan 2 kali, yaitu 1 48 jam setelah sediaan
selesai dibuat dan 2 setelah penyimpanan 1 bulan untuk mengetahui stabilitas fisik berupa pergeseran viskositas.
7. Uji daya antibakteri emulgel minyak cengkeh terhadap S. epidermidis
a. Pembuatan stok bakteri S. epidermidis. Media Muller-Hinton Agar MHA dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Tabung reaksi yang berisi media dimiringkan dan dibiarkan memadat. Diambil 1 ose
biakan murni S. epidermidis dan diinokulasikan secara goresan pada media MHA miring, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37
o
C dalam inkubator.
b. Pembiakan bakteri S. epidermidis dalam media cair. Diambil 2 ose koloni bakteri S. epidermidis dari stok bakteri, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang telah berisi media Muller-Hinton Broth steril, kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37
o
C dalam inkubator sampai memberikan kekeruhan standar 0,5 Mac Farland 1,5 x 10
8
CFUmL. c. Pembuatan kontrol media. Media MHA steril dituang ke dalam cawan petri,
dan ditunggu hingga memadat, kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37
o
C dalam inkubator. Setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan dan kontrol pertumbuhan.
d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji S. epidermidis. Bakteri uji dituang ke dalam petri steril sama dengan volume dan kepadatan bakteri uji
pada perlakuan yaitu 1 mL, ditambahkan Media MHA hangat suam kuku yang sudah disterilisasi, kemudian cawan petri digoyang sehingga
pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi, diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media dibandingkan dengan
komtrol media dan perlakuan. e. Uji daya antibakteri emulgel minyak cengkeh terhadap S. epidermidis.
Dibuat 5 lubang sumuran dengan diameter 0,8 cm pada cawan petri berdiameter 15 cm yang berisi media MHA yang sudah padat dan sudah
diinokulasi dengan S. epidermidis. Masing-masing lubang sumuran diisi dengan basis kontrol negatif dan emulgel minyak cengkeh yakni 4 formula
sebanyak 0,1 gram. Cawan petri dibungkus menggunakan aluminium foil, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37
o
C. Setelah inkubasi, diameter zona hambat diukur. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Kontrol
media dan kontrol pertumbuhan bakteri dibuat sebagai pengendali uji.
F. Analisis Data
Respon untuk semua formula berupa hasil uji sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel dianalisis menggunakan uji hipotesis komparatif variabel numerik
dua kelompok tidak berpasangan yang dibagi menjadi dua menurut kenormalan distribusi data. Apabila data berdistribusi normal, maka data dianalisis dengan
menggunakan uji hipotesis komparatif variabel numerik berdistribusi normal dua kelompok yaitu uji T tidak berpasangan, sebaliknya apabila data berdistribusi
tidak normal, maka data dianalisis dengan uji hipotesis komparatif variabel numerik distribusi tidak normal yaitu uji Mann-whitney atau Wilcoxon two
sample. Dengan uji hipotesis komparatif variabel numerik dua kelompok dapat
diketahui ada tidaknya perbedaan antara lama pencampuran 5 menit dengan variasi suhu dan lama pencampuran 15 menit dengan variasi suhu dalam
menentukan sifat fisik dan stabilitas fisik sediaan emulgel. Analisis ini
menggunakan program R-2.14.1.
32
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi Bahan
Identifikasi bahan perlu dilakukan untuk memastikan bahwa bahan yang akan digunakan dalam penelitian sudah sesuai sehingga hasil penelitian tidak bias.
Minyak cengkeh yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari CV. Indaroma, Yogyakarta. Minyak cengkeh yang digunakan merupakan minyak atsiri
dari daun tanaman cengkeh yang telah diuji identitasnya dan dibuktikan dengan Certificate of Analysis CoA terlampir Lampiran 1.
Identifikasi minyak cengkeh berupa pengamatan organoleptis meliputi warna dan bau. Karakteristik warna minyak cengkeh daun adalah jerami atau
sangat pucat, dengan bau yaitu kuat, menyengat, dan aromatik atau khas Parthasarathy, Chempakam, and Zachariah, 2008; Peter, 2007. Hasil
pengamatan warna minyak cengkeh adalah berwarna jerami dan memiliki bau kuat, menyengat, dan khas. Oleh karena itu, berdasarkan identifikasi organoleptis
bau dan warna, maka minyak yang diperoleh merupakan minyak cengkeh daun.
B. Verifikasi Minyak Cengkeh
Verifikasi yang dilakukan terhadap minyak cengkeh yang diperoleh dari CV. Indaroma pada penelitian ini terdiri dari pengujian indeks bias dan bobot
jenis. Tujuan verifikasi ini adalah untuk membuktikan identitas dari minyak cengkeh yang digunakan. Hasil yang diperoleh dari verifikasi sifat fisik minyak
Kategori