Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Penelitian Tahap Pertama

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei 2008 – Februari 2009. Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Entomologi bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gelas piala, gelas ukur, gelas plastik, sudip, timbangan digital, pipet mikro, termometer, hot plate dan magnetic stirrer, oven, gelas pengaduk, gelas plastik, kasa kain, alumunium foil, cetakan paralon 1,5 inchi dengan tinggi 8 cm, glass chamber berukuran 100 x 100 x 100 cm, aspirator, tabung reaksi, cawan petri, vortex, dan inkubator. Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi bahan pembuatan gel penolak nyamuk dan bahan untuk pengujian. Bahan pembuatan gel penolak nyamuk antara lain karagenan semi refined yang di produksi oleh PT. Araminta Sidhakarya dengan kode produk SR.EC.01, aquades steril, metil paraben, propil paraben, alkohol, dan minyak sereh. Bahan uji terdiri dari nyamuk Culex quinquefasciatus betina dewasa untuk pengujian efikasi terhadap nyamuk serta bahan uji mikroba dan jamur berupa media NA, media PDA Potato Dextrose Agar , dan larutan garam fisiologis.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama bertujuan menentukan konsentrasi karagenan terbaik pada formula gel. Tahap kedua bertujuan untuk melihat pengaruh kombinasi karagenan terpilih dan minyak sereh terhadap karakteristik warna, kekerasan, dan Water Holding Capacity gel penolak nyamuk yang dihasilkan, mengetahui keampuhan berbagai konsentrasi minyak sereh wangi dalam gel penolak nyamuk terhadap nyamuk rumah Culex quinquefasciatus , dan mengetahui jumlah cemaran mikroba pada gel 17 penolak nyamuk terpilih setelah masa pemaparan dan masa simpan 30 hari. Tabel pengukuran susut berat disajikan pada Lampiran 1.

3.3.1 Penelitian tahap pertama

Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi karagenan yang menghasilkan tekstur gel terbaik. Selanjutnya, konsentrasi karagenan yang baik digunakan dalam penelitian tahap selanjutnya. Proses pembuatan gel diawali dengan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan. Konsentrasi karagenan terpilih 1 ; 1,5 ; 3 ; 5 dan 6 dipanaskan dalam aquades steril hingga suhu mencapai 70 °C. Setelah suhu mencapai 70 °C, suhu diturunkan hingga kisaran 65-68 °C untuk ditambahkan metil paraben dan propil paraben, selanjutnya produk gel dicetak. Masing-masing produk dilakukan dua kali ulangan. Hasil gel penolak nyamuk dengan tingkat tekstur terbaik kemudian digunakan dalam penelitian tahap selanjutnya. Prosedur pembuatan gel penolak nyamuk dimodifikasi dari Hargreaves 2003 dapat dilihat pada Gambar 3 dan perlakuan yang digunakan pada penelitian tahap pertama dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Perlakuan pada penelitian tahap pertama Perlakuan A01 A02 A03 A04 A05 Bahan ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ Karagenan g 1 1 1,5 1,5 3 3 5 5 6 6 Akuades steril ml 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 Metil Paraben g 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Propil Paraben g 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Keterangan : ∑ = jumlah dalam berat atau volume karagenan = berat karagenan per berat pelarut A01 = produk gel dengan konsentrasi karagenan 1 A02 = produk gel dengan konsentrasi karagenan 1,5 A03 = produk gel dengan konsentrasi karagenan 3 A04 = produk gel dengan konsentrasi karagenan 5 A05 = produk gel dengan konsentrasi karagenan 6 18

3.3.2 Penelitian tahap dua

Penelitian tahap kedua bertujuan mengetahui pengaruh kombinasi konsentrasi karagenan terpilih dan berbagai konsentrasi minyak sereh wangi terhadap karakteristik warna, kekerasan, dan Water Holding Capacity gel penolak nyamuk yang dihasilkan, mengetahui keampuhan berbagai konsentrasi minyak sereh wangi dalam gel penolak nyamuk terhadap nyamuk rumah Culex quinquefasciatus , dan mengetahui jumlah cemaran mikroba pada gel penolak nyamuk terpilih setelah masa pemaparan dan masa simpan 30 hari. Proses pembuatan gel penolak nyamuk diawali dengan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan. Konsentrasi karagenan terpilih 5 dipanaskan dalam aquades steril hingga suhu mencapai 70 °C. Setelah suhu mencapai 70 °C, suhu diturunkan hingga kisaran 65-68 °C untuk ditambahkan metil paraben dan propil paraben. Kemudian suhu diturunkan hingga 55-60 °C, ditambahkan minyak sereh sebagai pengharum sekaligus penolak nyamuk dan selanjutnya dicetak. Diagram alir pembuatan gel penolak nyamuk dapat dilihat pada Gambar 3. Perlakuan yang digunakan adalah perlakuan tanpa minyak sereh K01, penambahan konsentrasi minyak sereh 10 K02, penambahan minyak sereh 15 K03, dan penambahan minyak sereh 20 K04. Kemudian masing- masing perlakuan diukur susut beratnya dengan keadaan produk hanya terbuka bagian atas, uji efikasi terhadap nyamuk Culex quinquefasciatus, dan uji mikrobiologi uji mikroba dan uji jamur. 19 Karagenan Akuades steril Pemanasan hingga suhu 70°C metil paraben dan propil paraben Pengadukan hingga homogen Penurunan suhu hingga 55-60 °C minyak sereh Pengadukan hingga homogen Pencetakan dalam wadah dan pendinginan Gel penolak nyamuk Gambar 3. Diagram alir pembuatan gel penolak nyamuk Modifikasi dari Hargreaves 2003

3.4 Metode Pengujian

Dalam penelitian ini terdapat beberapa macam pengujian yaitu uji WHC Water Holding Capacity, uji efikasi, dan uji mikrobiologi. Prosedur kerja dari masing-masing pengujian adalah sebagai berikut:

3.4.1 Uji WHC Water Holding Capacity

Penentuan WHC dilakukan secara grafimetri selama 30 hari dalam keadaan bagian atas produk terbuka. WHC produk dilihat dari berat gel tersisa terhadap berat awal hingga akhir pengamatan. Kelembapan dan kestabilan produk 20 dinyatakan sebagai kemampuan produk dalam mempertahankan kehilangan beratnya terhadap pengaruh lingkungan. Kehilangan berat yang kecil menandakan bahwa produk memiliki tingkat kestabilan dan kelembapan yang tinggi Hidayat 2006. Menurut Suryani et al. 2000, hasil penghitungan uji kestabilan produk menggunakan rumus sebagai berikut :

3.4.2 Uji efikasi

Uji efikasi dilakukan untuk melihat keampuhan kombinasi karagenan sebagai pembentuk gel dan minyak sereh sebagai pembunuh nyamuk pada produk penolak nyamuk berbentuk gel. Glass chamber berukuran 100 x 100 x 100 cm dibersihkan. Selanjutnya dilakukan uji evaluasi ruang dengan memasukkan 10 ekor nyamuk Culex quinquefasciatus betina dewasa berusia 3-5 hari dari ruang penangkaran yang kenyang air gula. Nyamuk yang kenyang air gula dapat dilihat dari ukuran perut yang besar. Nyamuk tersebut dimasukkan ke dalam glass chamber selama 10 menit untuk memastikan bahwa kondisi ruangan sama dengan keadaan ruang penangkaran dan tidak mempunyai pengaruh terhadap kematian serangga uji. Uji efikasi hanya dapat dilanjutkan apabila kematian tidak lebih dari 4 populasi uji pada uji evaluasi ruang Pusat Perizinan dan InvestasiKomisi Pestisida 2007. Setelah uji evaluasi ruang selesai dilakukan dan memiliki kondisi yang sesuai untuk pengujian lanjutan, nyamuk Cx. quinquefasciatus betina dewasa berumur 3 - 5 hari yang kenyang air gula ditambahkan hingga berjumlah 25 ekor. Kemudian produk gel sebanyak 37 gram dimasukkan ke dalam glass chamber dan diamati selama 6 jam dengan frekuensi bertingkat. Pada 10 menit pertama diamati tiap menit kemudian diamati setiap 10 menit pada satu jam pertama. Selanjutnya pengamatan dilakukan setiap jam dari jam ke-2 hingga jam ke-6. Pengamatan tersebut berupa penghitungan jumlah nyamuk yang jatuh selama penelitian. Setiap nyamuk yang jatuh dihitung dan dicatat Kim et al. 2005. Uji efikasi dilakukan terhadap gel dengan tiga konsentrasi minyak sereh yang berbeda dan pengujian dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Sebelum dan sesudah 21 pengujian, dilakukan pengukuran temperatur dan kelembapan. Setelah 6 jam, nyamuk yang jatuh dipindahkan ke dalam wadah gelas plastik yang ditutup dengan kasa dan didiamkan selama 24 jam. Hasil uji terbaik dapat dilihat dari banyaknya nyamuk yang jatuhmati Boesri et al. 2001. Tabel uji angka kejatuhan dan angka kematian hewan uji disajikan pada Lampiran 2. Persentase kematian dalam uji efikasi ditentukan dengan menggunakan rumus: Keterangan : P = Jumlah nyamuk pingsan. Q = Jumlah nyamuk mati. R = Jumlah nyamuk yang diuji. Apabila angka kelumpuhan kematian pada kelompok kontrol melebihi 5 tetapi kurang dari 15 , maka angka kelumpuhan kematian pada kelompok perlakuan dikoreksi menurut rumus Abbot, yaitu : Keterangan : Al = angka kematian atau kelumpuhan setelah dikoreksi A = angka kelumpuhan atau kematian pada kelompok perlakuan C = angka kelumpuhan atau kematian pada kelompok kontrol 3.4.3 Uji cemaran mikroba 3.4.3.1 Uji Total Plate Count SNI 19-2897-1992 Pengujian karakteristik mikrobiologis gel penolak nyamuk dilakukan dengan metode angka lempeng total. Pengujian karakteristik mikrobiologis ini dilakukan sebanyak tiga kali yakni pada hari pertama, setelah dipaparkan dengan udara dan setelah masa simpan 30 hari. Berikut ini merupakan uraian mengenai prosedur pengujian angka lempeng total. Sebelum dilakukan pengujian, semua alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan dengan autoclave. Satu gram produk dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam 0,85 steril, sehingga diperoleh 22 pengenceran pertama 1:10. Hasil pengencaran dihomogenkan dengan menggunakan vortex, kemudian dilanjutkan sampai pengenceran yang diperlukan. Hal ini dilakukan dengan cara mengambil 1 ml larutan pengenceran sebelumnya. Kemudian ditambahkan ke dalam 9 ml larutan garam 0,85 steril yang lain dan memperoleh pengenceran selanjutnya. Satu mililiter dari masing-masing pengenceran dipipet ke dalam cawan petri steril. Media Nutrien Agar NA steril seperti tercantum pada Tabel 5 dicairkan kemudian didinginkan pada suhu sekitar 45 °C. Sebanyak 15 ml media NA tersebut dituang ke dalam cawan petri yang telah berisi sampel produk. Cawan yang berisi sampel produk dan media NA digerakkan melingkar atau seperti angka delapan diatas meja hingga tercampur homogen. Setelah agar memadat, cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu sekitar 35 ± 2 °C selama 24-48 jam. Setelah itu, pertumbuhan koloni diamati dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap cawan. Setiap cawan yang mengandung 25-300 koloni dicatat jumlah koloninya. Angka lempeng total dalam 1 ml produk dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan dengan faktor pengenceran yang sesuai Fardiaz 1993. Tabel 5. Komposisi media Nutrien Agar Komposisi Jumlah Peptone g 5,0 Beef extract g 3,0 Agar g 15,0 Aquades l 1,0 Sumber : BSN 1992

3.4.3.2 Uji jamur SNI 19-2897-1992

Jumlah koloni jamur dihitung dengan metode Standar Plate Count SPC dengan media Potato Dextrose Agar PDA. Pengujian pertumbuhan jamur dilakukan sebanyak tiga kali yakni pada hari pertama, setelah dipaparkan dengan udara dan setelah masa simpan selama 30 hari. Berikut ini merupakan uraian mengenai prosedur pengujian pertumbuhan jamur. Produk ditimbang sebanyak 1 gram disuspensikan ke dalam 9 ml larutan 0,85 NaCl. Satu mililiter dari masing-masing pengenceran dipindahkan ke 23 dalam cawan petri steril. Media Potato Dextrose Agar PDA dicairkan kemudian didinginkan pada suhu sekitar 45 °C. Sebanyak 15 ml media PDA tersebut dituang ke dalam cawan petri yang telah berisi sampel produk. Cawan yang berisi sampel produk dan media PDA digerakkan melingkar atau seperti angka delapan diatas meja hingga tercampur homogen. Setelah agar memadat, cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu sekitar 25-30 °C selama 5 hari. Komposisi media PDA dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. Komposisi media Potato Dextrose Agar Komposisi gramliter Potato Starch 4 Dextrose 20 Agar 15 Sumber : MacFaddin 1985

3.4.4 Rancangan Percobaan

Rancangan Percobaan yang digunakan dalam penelitian ini secara umum adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan dua ulangan. Rancangan percobaan tersebut memiliki model matematika sebagai berikut Mattjik dan Sumertajaya 2006. Y ij = µ + σi + ε ij Keterangan : Y ij = Nilai pengamatan ke-j dari pengaruh perlakuan ke-i µ = Rataan umum σ i = Pengaruh perlakuan ke-i ε ij = Pengaruh galat i = Jumlah perlakuan j = Ulangan Data yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan metode sidik ragam. Apabila diantara perlakuan menunjukkan hasil yang berbeda maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji lanjut Duncan Mattjik dan Sumertajaya 2006. 24 Hipotesis yang digunakan dalam penelitian ini adalah : H : Perbedaan konsentrasi minyak sereh tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase angka kejatuhan kematian nyamuk H 1 : Perbedaan konsentrasi minyak sereh memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase angka kejatuhan kematian nyamuk 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penelitian Tahap Pertama

Penolak nyamuk merupakan salah satu cara kerja suatu insektisida. Gel penolak nyamuk ini memiliki cara kerja yang hampir sama dengan pengharum ruangan yakni melepaskan wewangian atau aroma ke ruangan Conectique forum 2008. Penggunaan karagenan dalam pembuatan pengharum ruangan berbentuk gel umumnya menggunakan konsentrasi antara 1-3 Hargreaves 2003. Kappa karagenan yang biasa dikombinasikan dengan gum jenis lain pada produk pengharum ruangan sekitar 2,5 Van de Velde dan De Ruiter 2005. Penelitian tahap pertama dilakukan dengan mencoba beberapa macam formulasi untuk menghasilkan produk gel terbaik. Pada penelitian tahap pertama karagenan dengan konsentrasi berbeda yaitu 1 ; 1,5 ; 3 ; 5 ; dan 6 di campurkan dengan akuades steril, metil paraben, dan propil paraben yang diberikan memiliki jumlah konsentrasi yang sama pada tiap produk yakni masing- masing sebesar 99,6 ; 0,2 ; dan 0,2 . Pada tahap ini, masing-masing produk tidak diberikan tambahan minyak sereh. Hasil data formulasi gel penelitian tahap pertama memiliki karakteristik seperti terlihat pada Tabel 7. Tabel 7. Hasil formulasi gel pada penelitian tahap pertama Kode Konsentasi karagenan Keterangan produk A01 1 Terbentuk larutan gel gel produk tidak terbentuk A02 1,5 Gel produk lunak, mudah patah A03 3 Gel produk rapuh, mudah patah, mengalami sineresis A04 5 Gel produk kenyal-keras, tidak mudah patah A05 6 Gel produk cepat terbentuk, serbuk karagenan masih tersisa, sulit diaduk. 26 Penelitian tahap pertama dilakukan untuk mendapatkan kondisi tekstur dan kepadatan terbaik pada saat formulasi gel. Pada tahap ini, tekstur suatu produk dipengaruhi oleh jumlah air yang ada di dalam produk. Semakin tinggi konsentrasi karagenan dan semakin kecil proporsi kandungan air dalam suatu produk, maka tingkat kekerasannya akan semakin tinggi. Berdasarkan pengamatan terhadap tekstur dan kekerasan, didapatkan gel dengan konsentrasi karagenan 1 tidak dapat membentuk gel yang stabil karena pada konsentrasi tersebut karagenan hanya berfungsi sebagai pengental cairan Fardiaz 1989. Produk dengan konsentrasi karagenan 1,5 memiliki karakteristik gel yang mudah patah, lunak, dan mudah hancur. Gel dengan konsentrasi karagenan 3 memiliki karakteristik yang mudah patah, rapuh, dan mengalami sineresis. Sineresis adalah peristiwa keluarnya air dari produk gel yang disebabkan oleh terbentuknya gel yang semakin mengeras dan mengerut akibat proses pendinginan. Pada suhu di atas titik cair gel, polimer- polimer karagenan dalam larutan membentuk coil acak. Pada saat pendinginan, formasi coil acak berubah menjadi heliks ganda yang memungkinkan terbentuknya ikatan-ikatan silang yang membentuk jala atau jaringan kontinyu. Pendinginan selanjutnya menyebabkan polimer-polimer menjadi terikat silang secara kuat dan makin bertambahnya bentuk heliks akan terbentuk agregat yang bertanggung jawab terhadap terbentuknya gel yang kuat. Jika diteruskan, ada kemungkinan agregat terus terjadi dan gel terus mengerut sambil melepas air. Proses terakhir dinamakan sineresis Fardiaz 1989. Produk gel dengan konsentrasi karagenan 5 memiliki karakteristik yang paling baik, yakni tidak mudah patah, kenyal-keras, dan tidak mengalami sineresis. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi karagenan yang lebih tinggi memiliki kandungan selulosa yang lebih besar sehingga akan memberikan tekstur gel yang lembut dan elastis Imeson 2000. Selain itu, produk gel dengan konsentrasi karagenan 5 memiliki proporsi kandungan air yang lebih kecil daripada gel penolak nyamuk dengan konsentrasi karagenan 1 ; 1,5 dan 3 sehingga tingkat kekerasan gel semakin besar pula Van de Velde dan De Ruiter 2005. 27 Konsentrasi karagenan 6 , gel lebih dulu terbentuk sebelum tepung karagenan secara keseluruhan tercampur homogen sehingga sangat sulit untuk diaduk. Hal ini dikarenakan gel karagenan 6 memiliki proporsi kandungan air yang lebih kecil daripada produk gel dengan konsentrasi lainnya 1 ; 1,5 ; 3 dan 5 , sehingga molekul karagenan yang terikat pada air terlalu banyak dan menyebabkan terbentuknya gel yang sangat kuat.

4.2 Penelitian Tahap Kedua