43 digunakan pereaksi AlCl
3,
NH
3
dan FeCl
3
. Cara kerja: larutan ekstrak ditotolkan pada kertas Whatmann, kemudian
dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap pengembang dan ditutup rapat, setelah elusi selesai plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan
di udara, kemudian disemprot dengan pereaksi AlCl
3,
NH
3
dan FeCl
3
. Warna bercak yang terjadi diamati dan dihitung harga Rf-nya.
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antimikroba ini disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada
suhu 170
o
C selama 1-2 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan dibakar di atas lampu
bunsen.
3.9 Pembuatan Media Nutrien Agar
Komposisi: beef extract 5 gram Pepton
3 gram Agar
12 gram Cara pembuatan agar:
Sebanyak 23 gram nutrien agar NA dimasukkan ke dalam erlemenyer, tambahkan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut kemudian disterilkan
di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.10 Pembuatan Media Agar Miring
Sebanyak 3 ml media nutrient agar steril dimasukkan ke dalam tabung
44 reaksi yang steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan membeku
pada posisi miring membentuk sudut 45
o
C, disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5
o
C.
3.11 Pembuatan Larutan NaCl 0,9
Komposisi: Natrium klorida 0,9 gram
Air suling ad 100 ml Cara pembuatan:
Natrium klorida ditimbang sebanyak 0,9 gram, dilarutkan dengan air suling steril sedikit demi sedikit sampai 100 ml kemudian disterilkan di autoklaf
pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.12 Pembiakan Bakteri 3.12.1 Pembuatan stok kultur
Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril lalu ditanamkan pada media nutrien agar miring dengan cara menggores, setelah itu
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ±1
o
C selama 18-24 jam Ditjen POM,
1995. 3.12.2 Pembuatan Inokulum
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml larutan NaCl 0,9 steril lalu
diukur kekeruhannya sampai didapat transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995.
45
3.13 Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi
Sebanyak 1 g ekstrak etanol, fraksi n-heksana dan fraksi etilasetat kulit buah petai dilarutkan dalam dimethyl sulfoxida DMSO, lalu dicukupkan
sampai 2 ml. Konsentrasi ekstrak dan fraksi-fraksi adalah 500 mgml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100
mgml, 75 mgml, 50 mgml, 25 mgml dan 12,5 mgml.
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri
