18
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian eksperimental murni menggunakan metode desain faktorial menggunakan dua faktor dan dua level
untuk menghasilkan formula optimum emulgel minyak cengkeh sebagai penyembuh jerawat.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi carbopol 940
sebagai gelling agent dan gliserin sebagai humectant dalam 2 level level rendah dan level tinggi.
b. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1 Sifat fisik emulgel minyak cengkeh : daya sebar dan viskositas. 2 Stabilitas emulgel minyak cengkeh : pergeseran viskositas setelah
penyimpanan selama satu bulan. 3 Iritasi primer : eritema dan edema
4 Daya antibakteri : diameter zona hambat
c. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kecepatan,
lama, dan suhu pengadukan dalam pembuatan sediaan emulgel minyak cengkeh, lama penyimpanan, kondisi penyimpanan, sifat dari wadah
penyimpanan, berat badan dan umur kelinci, suhu inkubasi, lama inkubasi, dan kepadatan Staphylococcus epidermidis.
d. Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu
ruangan pada saat pembuatan dan pengujian emulgel minyak cengkeh, dan kemungkinan penguapan minyak cengkeh, serta kondisi fisiologi dan patologi
kelinci.
2. Definisi operasional a.
Optimasi adalah proses untuk mendapatkan formula optimum dalam level
yang diteliti.
b. Minyak cengkeh adalah minyak essensial yang berasal dari daun tanaman
cengkeh Syzygium aromaticum L. dengan kandungan eugenol 74,08 yang diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta.
c. Emulgel minyak cengkeh adalah sediaan topikal semisolid hasil
emulsifikasi dan penambahan carbopol 940 sebagai gelling agent dengan bahan aktif minyak cengkeh yang digunakan untuk mengobati jerawat
acne yang dibuat sesuai dengan formula yang tercantum pada penelitian ini.
d. Gelling agent adalah suatu zat yang dapat membentuk suatu massa gel,
yang berfungsi untuk mengentalkan dan menstabilkan emulgel minyak cengkeh. Pada penelitian ini menggunakan carbopol 940.
e. Humectant adalah suatu zat yang berfungsi sebagai pelembab, yang
berfungsi untuk mempertahankan kandungan air pada emulgel minyak cengkeh. Pada penelitian ini menggunakan gliserin.
f. Desain Faktorial adalah desain penelitian yang dapat digunakan untuk
mengetahui efek yang signifikan dari penambahan carbopol 940 dan gliserin dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel minyak
cengkeh. g.
Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini
digunakan 2 faktor, yaitu penambahan carbopol 940 dan gliserin.
h. Level adalah nilai untuk faktor, dalam penelitian ini terdapat 2 level, yaitu
level rendah dan level tinggi. Level rendah penambahan carbopol 940 sebanyak 2,0 gram dan level tinggi sebanyak 5,0 gram. Level rendah
penambahan gliserin sebanyak 4,0 gram dan level tinggi sebanyak 12,0 gram.
i. Respon adalah besaran yang diamati perubahan efeknya, besarnya dapat
dikuantitatifkan. Respon dalam penelitian ini adalah sifat fisik emulgel minyak cengkeh daya sebar dan viskositas dan stabilitas emulgel minyak
cengkeh pergeseran viskositas.
j. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan oleh variasi level dan
faktor.
k. Sifat fisik emulgel minyak cengkeh adalah parameter untuk mengetahui
kualitas fisik emulgel minyak cengkeh, dalam penelitian ini adalah viskositas dan daya sebar 48 jam setelah pembuatan serta stabilitas
viskositas setelah 1 bulan penyimpanan.
l. Viskositas adalah suatu pertahanan dari emulgel minyak cengkeh untuk
mengalir setelah adanya pemberian gaya. Semakin besar viskositas, maka emulgel minyak cengkeh akan makin tidak mudah untuk mengalir.
m. Daya sebar adalah diameter penyebaran tiap 1 gram emulgel minyak
cengkeh pada alat uji daya sebar yang diberi beban 50 gram dan didiamkan selama 1 menit.
n. Pergeseran viskositas adalah selisih dari viskositas emulgel minyak
cengkeh setelah 1 bulan penyimpanan dengan viskositas emulgel minyak cengkeh setelah 48 jam pembuatan yang dipersentasekan.
o. Iritasi primer adalah proses peradangan yang mungkin timbul setelah
pengaplikasian sediaan emulgel minyak cengkeh yang ditandai dengan timbulnya eritema dan edema. Eritema adalah kemerahan pada kulit yang
disebabkan oleh pelebaran kapiler dan bersifat reversible, sedangkan edema adalah pembengkakan yang disebabkan oleh terkumpulnya cairan secara
berlebih pada jaringan tubuh.
p. Daya antibakteri emulgel minyak cengkeh adalah kemampuan dari
emulgel minyak cengkeh dalam menghambat atau membunuh bakteri Staphylococcus epidermidis
penyebab jerawat, ditunjukkan oleh adanya diameter zona hambat yang dihasilkan.
q. Zona hambat adalah zona jernih di mana tidak dijumpai pertumbuhan
bakteri Staphylococcus epidermidis atau terdapat pertumbuhan sedikit sekali dibandingkan dengan kontrol pertumbuhan.
r. Staphylococcus epidermidis adalah salah satu bakteri penyebab jerawat
yang berasal dari kultur murni Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
yang diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.
C. Alat
Glasswares merk pyrex Japan, neraca, waterbath, mixer merk Phillips,
pipet ukur, cawan petri, tabung reaksi, viscotester seri VT 04 RION-JAPAN, stopwatch
, alat pengukur daya sebar, refractometer ABBE, piknometer, vortex, pipet mikro 5-
100 L, jarum ose, alat pembuat sumuran, autoklaf, dan inkubator.
D. Bahan
Minyak cengkeh, carbopol 940 kualitas farmasetis, gliserin kualitas farmasetis, Tween 80 dan Span 80 kualitas farmasetis, parafin cair kualitas
farmasetis, trietanolamin TEA, aquadest, etanol 70, media Muller-Hinton Broth
Merck, media Muller-Hinton Agar Oxoid, dan bakteri uji
Staphylococcus epidermidis.
E. Tata Cara Penelitian 1. Verifikasi minyak cengkeh
Verifikasi minyak cengkeh yang dilakukan pada penelitian ini, meliputi : a. Identifikasi bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini, yaitu : Minyak cengkeh yang merupakan minyak essensial dari tanaman cengkeh
Syzygium aromaticum L. yang telah diuji identitasnya, dibuktikan dengan Certificate of Analysis.
b. Verifikasi indeks bias minyak cengkeh Indeks bias dari minyak cengkeh diukur dengan menggunakan
refractometer ABBE. Minyak cengkeh diteteskan pada prisma utama, kemudian
prisma ditutup dan ujung refraktometer diarahkan ke cahaya terang, sehingga melalui lensa skala sehingga dapat dilihat dengan jelas dan ditentukan nilai indeks
biasnya. Refraktometer dialiri air mengalir dan diatur suhunya menjadi 20ºC. Nilai indeks bias minyak cengkeh ditunjukkan oleh garis batas yang memisahkan
sisi terang dan sisi gelap pada bagian atas dan bawah. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
c. Verifikasi bobot jenis minyak cengkeh Bobot jenis minyak cengkeh diukur dengan menggunakan piknometer
yang telah dikalibrasi, dengan menetapkan bobot piknometer kosong dan bobot air pada suhu 25ºC. Piknometer diisi minyak cengkeh dan suhu dikondisikan pada
25ºC, kemudian piknometer ditimbang. Bobot piknometer yang telah diisi minyak cengkeh kemudian dikurangi bobot piknometer kosong. Bobot jenis minyak
cengkeh merupakan perbandingan antara bobot jenis minyak cengkeh dengan bobot air, pada suhu 25ºC. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
2. Formula Tabel I. Formula emulgel minyak cengkeh yang telah dimodifikasi 200 g
Bahan Satuan g
Minyak Cengkeh 30
Carbopol 940 1,5-5,0
Trietanolamin 1,5
Parafin cair 2
Tween 80 35
Span 80 5
Gliserin 1,5-6,5
Metil Paraben 0,36
Propil paraben 0,05
Aquadest 110
Tabel II. Level rendah dan level tinggi carbopol 940 dan gliserin pada formula emulgel minyak cengkeh berdasarkan hasil orientasi
Formula Carbopol 940
Gliserin
1 1,5 g
1,5 g a
5,0 g 1,5 g
b 1,5 g
6,5 g ab
5,0 g 6,5 g
Keterangan F 1 = Carbopol 940 level rendah,gliserin level rendah
F a = Carbopol 940 level tinggi, gliserin level rendah F b = Carbopol 940 level rendah, gliserin level tinggi
F ab = Carbopol 940 level tinggi, gliserin level tinggi
Berdasarkan tabel tersebut, dibuat 4 formula emulgel minyak cengkeh sebagai berikut :
Tabel III. Formula emulgel minyak cengkeh 200 g Formula
1 a
b ab
Minyak Cengkeh 30 g
30 g 30 g
30 g
Carbopol 940 1,5 g
5,0 g 1,5 g
5,0 g
Trietanolamin 1,5 g
1,5 g 1,5 g
1,5 g Parafin cair
2 g 2 g
2 g 2 g
Tween 80 35 g
35 g 35 g
35 g Span 80
5 g 5 g
5 g 5 g
Gliserin 1,5 g
1,5 g 6,5 g
6,5 g
Metil Paraben 0,36 g
0,36 g 0,36 g
0,36 g Propil paraben
0,05 g 0,05 g
0,05 g 0,05 g
Aquadest 110 g
110 g 110 g
110 g
3. Pembuatan emulgel minyak cengkeh
Carbopol 940 dikembangkan dengan menggunakan 70 mL aquadest dari formula selama 24 jam, kemudian semua bahan yang termasuk dalam fase minyak
minyak cengkeh, parafin cair, propil paraben dan Span 80 dicampur terlebih dahulu pada suhu 50°C diatas waterbath demikian halnya dengan fase air
gliserin, aquadest, metil paraben dan Tween 80. Campuran fase minyak dicampurkan dengan fase air menggunakan mixer dengan kecepatan 300 rpm
selama 10 menit pada suhu 50°C. Emulsi selanjutnya dicampurkan dengan carbopol 940 yang sebelumnya
telah dikembangkan dengan 70mL aquadest dari formula menggunakan mixer dengan kecepatan putar 300 rpm selama 10 menit pada suhu ruangan. Kemudian
Trietanolamin TEA ditambahkan ke dalam campuran, dan campuran diaduk kembali menggunakan mixer dengan kecepatan 300 rpm selama 5 menit.
4. Uji iritasi primer emulgel minyak cengkeh
Kelinci dengan berat 1,2-1,5 kg dengan umur kira-kira 3 bulan bebas dari segala tanda penyakit dipilih. Rambut pada punggung kelinci dicukur, setelah itu
dibersihkan dengan air suling. Kemudian sejumlah 0,5 gram basis dan emulgel pada sisi yang berbeda diaplikasikan ke punggung kelinci yang telah dicukur tadi.
Diamati gejala iritasi yang mungkin timbul eritema dan edema pada waktu 24, 48 dan 72 jam.
5. Uji pH emulgel minyak cengkeh
Pengukuran pH ini menggunakan indikator universal, yaitu dengan memasukkan indikator pH universal pH strips ke dalam emulgel minyak
cengkeh yang
telah dibuat.
Kemudian menentukan
pHnya dengan
membandingkan warna yang dihasilkan dengan standar.
6. Uji sifat fisik emulgel minyak cengkeh
a. Uji viskositas Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscometer Rion seri VT 04.
Emulgel dimasukkan ke dalam wadah hingga penuh dan dipasang pada portable viscotester
. Viskositas emulgel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas Instruction Manual Viscotester VT-04E. Uji ini dilakukan
48 jam setelah pembuatan untuk mengetahui efek faktor terhadap viskositas, sedangkan untuk mengetahui persentase pergeseran viskositasnya dilakukan
setelah 1 bulan penyimpanan. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini adalah antara 200-300 d.Pa.s.
b. Uji daya sebar Sediaan emulgel ditimbang seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca
bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan kaca bulat lain dengan berat 50 gram sebagai pemberat, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya.
Pengujian daya sebar dilakukan 48 jam setelah emulgel selesai dibuat. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Daya sebar yang dikehendaki di dalam penelitian ini
yaitu 3-5 cm.
7. Uji daya antibakteri emulgel minyak cengkeh terhadap Staphylococcus
epidermidis
a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus epidermidis Sebanyak 5 mL media Muller-Hinton Agar MHA dimasukkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, kemudian tabung reaksi dimiringkan
dan dibiarkan memadat. Diambil satu ose biakan murni Staphylococcus epidermidis
dan diinokulasikan secaran goresan zig-zag, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C dalam inkubator.
b. Pembuatan suspensi Staphylococcus epidermidis Diambil satu ose koloni bakteri dari stok bakteri, dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang telah berisi 10 mL Muller-Hinton Broth MHB yang sudah di sterilisasi, kemudian diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37°C dalam
inkubator. Selanjutnya, kekeruhan suspensi bakteri Staphylococcus epidermidis
disesuaikan dengan standar Mac Farland 0,5 1,5 x 10
8
CFUmL Isenberg, 1998.
c. Uji daya antibakteri emulgel minyak cengkeh terhadap Staphylococcus epidermidis
Dibuat lima petri berdiameter 15 cm yang telah berisi 30 mL MHA steril, satu petri dibuat kontrol negatif, yaitu kontrol media yang tidak diberi bakteri
Staphylococcus epidermidis, kemudian satu petri lainnya dibuat kontrol positif,
yaitu kontrol pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dengan cara ke dalam MHA hangat suam-suam kuku setelah sterilisasi diberi 1 mL suspensi
bakteri Staphylococcus epidermidis, kemudian diinkubasikan terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C dalam inkubator.
Tiga petri lainnya dengan perlakuan sama seperti kontrol pertumbuhan diberi masing-masing 1 mL suspensi bakteri Staphylococcus epidermidis dan
diberi lima lubang sumuran sampai ke dasar dengan diameter 8 mm pada cawan petri yang telah berisi MHA steril yang telah memadat. Kemudian dilakukan
penambalan kembali dengan media MHA yang sudah disterilisasi sebanyak 200 µL di tiap sumuran single layer method. Dalam masing-masing cawan petri, ke
dalam sumuran diberi basis, formula 1, formula a, formula b, dan formula ab, kemudian dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Setelah itu diinkunbasikan
terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C dalam inkubator. Kemudian diukur zona hambat yang dihasilkan.
F. Analisis Hasil
Data yang terkumpul adalah data uji viskositas dan uji daya sebar 48 jam setelah pembuatan, profil viskositas selama 1 bulan penyimpanan, data daya
antibakteri masing-masing formula emulgel minyak cengkeh. Data yang didapat dianalisis dengan uji Saphiro-Wilk untuk sampel yang
kurang dari atau sama dengan 50 untuk melihat kenormalan distribusi data dan uji kesamaan varians
Levene’s test untuk melihat kesamaan varians. Jika data sesuai dengan kriteria uji statistik parametrik, maka analisis dilanjutkan dengan
pengujian signifikansi menggunakan ANOVA. Jika data tidak memenuhi kriteria uji statistik parametrik, maka analisis data menggunakan Kruskal-Wallis dengan
post hoc Wilcoxon. Analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak
R-2.14.1.
G. Alur Penelitian
30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi dan Verifikasi Minyak Cengkeh
Pada penelitian ini menggunakan minyak cengkeh yang berasal dari CV. Indaroma Yogyakarta. Minyak cengkeh merupakan minyak atsiri yang berasal
dari daun tanaman cengkeh Syzygium aromaticum yang telah diidentifikasi melalui beberapa uji dan dibuktikan dengan Certificate of Analysis CoA
Lampiran 1. Pada tahap awal penelitian ini dilakukan uji organoleptis yang meliputi
bau, warna, dan rasa, serta verifikasi ulang dari minyak daun cengkeh untuk lebih memastikan apakah minyak yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah
minyak cengkeh. Verifikasi ini dilakukan meliputi bobot jenis minyak dan indeks bias minyak yang akan digunakan.
Minyak cengkeh yang berasal dari CV Indaroma Yogyakarta memiliki bau aromatis yang khas, memiliki warna kuning kecoklatan bening, dan memiliki rasa
pahit dan panas. Hasil verifikasi minyak cengkeh adalah sebagai berikut:
Tabel IV. Hasil verifikasi minyak cengkeh ̅ ± SD
Sifat Fisik Literatur
Panda, 2004 CoA
Hasil Verifikasi
Indeks bias 1,5231-1,5350
1,520-1,540 1,534 ± 0,001
Bobot jenis 1,036-1,046 gmL
1,010-1,035 gmL 1,0207 ± 0,002 gmL
Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa hasil verifikasi indeks bias minyak
cengkeh menurut Panda 2004 dan Certificate of Analysis CoA yang dilampirkan sesuai. Pada hasil verifikasi bobot jenis sesuai dengan CoA,
Kategori