21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Brine Shrimp Lethality Test BST ekstrak kloroform daun tumbuhan
tembelekan terhadap larva artemia merupakan jenis penelitian eksperimental murni denga n rancangan Posttest Only Control Group Design. Lokasi penelitian
adalah laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas: konsentrasi ekstrak kloroform daun tumb uhan tembelekan, yaitu 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml yang diujikan pada larva artemia.
b. Variabel tergantung: jumlah larva artemia yang mati akibat pemberian ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan berbagai
konsentrasi. c. Variabel pengacau terkendali, yaitu:
1. Umur larva artemia, yaitu 48 jam 2. Lingkungan tempat percobaan yang meliputi: pH air laut buatan antara
7-8 dengan kadar garam 5 per mil, cahaya untuk mempercepat penetasan larva artemia dengan menggunakan sinar lampu 5 watt, serta
suhu lingkungan yang optimal bagi kelangsungan hidup larva artemia yang berkisar antara 25-30°C.
3. Faktor jenis atau varietas tumbuhan tembelekan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
4. Teknik dan lamanya penyarian daun tumbuhan tembelekan. d. Variabel pengacau tak terkendali: kondisi lingkungan tempat tumbuh
tumbuhan tembelekan.
2. Definisi operasional
a. Median Lethal Concentration LC
50
adalah konsentrasi larutan senyawa uji yang menyebabkan kematian separuh dari hewan uji dengan perlakuan
selama 24 jam dan merupakan data kuantitatif yang diperoleh pada uji BST, dinyatakan dalam µgml.
b. Larva artemia yang mati adalah larva yang tidak menunjukkan adanya kehidupan yang ditandai dengan tidak adanya gerakan sekecil apa pun dari
larva. c. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan adalah ekstrak kental atau
kering yang dib uat dengan menyari daun tembelekan dalam pelarut kloroform dengan cara maserasi selama 48 jam.
d. Larva artemia adalah larva yang telah berumur 48 jam hasil penetasan siste artemia.
C. Bahan Penelitian
1. Bahan utama
Bahan penelitian ini berupa daun tumbuhan tembelekan yang diperoleh dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006.
2. Bahan untuk ekstraksi
Bahan untuk ekstraksi adalah kloroform pro analysis p.a MERCK.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
3. Bahan untuk KLT
Semua bahan untuk KLT berderajat p.a kecuali serbuk Liquiritiae Radix yang berderajat farmasetis.
1. Untuk uji flavonoid. Bahan yang digunakan antara lain selulosa MERCK, n-butanol, asam asetat, aquadest, ekstrak kloroform daun tumbuhan
tembelekan, pembanding rutin 1, uap ammonia, dan pereaksi AlCl
3
. 2. Untuk uji triterpenoid. Bahan yang digunakan antara lain silika gel GF 254
MERCK, toluene, etil asetat, ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, ekstrak kloroform Liquiritiae Radix dan pereaksi semprot vanilin asam sulfat.
4. Bahan untuk pembuatan air laut buatan
Semua bahan kimia untuk pembuatan air laut buatan berderajat teknis. Bahan-bahan tersebut adalah kalium klorida, kalsium klorida, magnesium klorida,
magnesium sulfat, natrium bikarbonat, natrium klorida, aquadest, aquadest bebas CO
2
, dan aquadest panas.
5. Bahan untuk uji toksisitas BST
a. Larva artemia yang berumur 48 jam merupakan hasil penetasan siste Artemia salina
Viper Jeannie Hoo., LTD, China dalam air laut buatan berkadar 5 permil.
b. Larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml.
c. Air laut buatan berkadar 5 permil. d. Suspensi Sacharomyces cerevisiae ragi sebagai makanan bagi larva
artemia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
D. Alat-alat Penelitian
1. Alat untuk ekstraksi
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi antara lain: blender, shaker Innova 2100, gelas ukur Pyrex, Erlenmeyer Pyrex, gelas Beker Pyrex,
sendok, pipet ukur, pipet volume, kertas saring, Vaccum Rotary Evaporator Janke Kunkel, Waterbath Memert, neraca analitik Mettler Toledo AB 204,
batang pengaduk, dan cawan porselen.
2. Alat untuk uji BST
Alat-alat yang digunakan untuk uji BST antara lain: flakon, bak penetas artemia, mikropipet Socorex ISBA S.A, lampu 5 watt dop, aerator Niko NK
1200, pipet tetes, pipet khusus BST, neraca analitik Mettler Toledo AB 204, dan Vortek Dijkstra.
3. Alat untuk KLT
Alat-alat yang digunakan untuk KLT antara lain: pipet kapiler, bejana kromatografi, alat semprot, kertas saring, dan lampu UV 254 dan 365 nm.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tumbuhan
Determinasi dilakukan untuk memastikan jenis tumbuhan tembelekan yang akan digunakan untuk penelitian. Determinasi tumbuhan tembelekan
dilakukan di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan menurut Van Stenis 1981.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
2. Pengumpulan bahan
Daun tumbuhan tembelekan dikumpulkan dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Daun tumbuhan tembelekan yang telah dikumpulkan
diambil daunnya, dicuci dengan menggunakan air mengalir, dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam. Setelah kering
kemudian diserbuk dengan cara diblender.
3. Pembuatan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan
Sebanyak 30 gram serbuk daun tumbuhan tembelekan ditimbang dan dimasukkan dalam Erlenmeyer dengan ditambah 225 ml kloroform. Erlenmeyer
ditutup dengan aluminium foil kemudian diletakkan pada shaker dengan laju konstan 120 rpm selama 24 jam lalu larutan disaring dengan kertas saring.
Maserat ditampung dan disimpan pada suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 225 ml kloroform menggunakan shaker 120 rpm selama
24 jam, lalu disaring dan maserat ditampung untuk digabungkan dengan maserat hasil maserasi 24 jam pertama.
Maserat yang terkumpul lalu dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator
sampai kental volume kira-kira 13 nya. Setelah itu, dengan menggunakan cawan porselen yang sudah ditimbang terlebih dahulu, ekstrak
diuapkan di atas waterbath dengan suhu 50 °
C dan dengan kipas angin sampai didapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering ini kemudian dibungkus rapat dan
disimpan dalam eksikator.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
4. Pembuatan air laut buatan
Air laut buatan diperoleh dengan cara melarutkan: 5,0 g natrium klorida NaCl; 1,3 g magnesium sulfat MgSO
4
; 1,0 g magnesium klorida MgCl
2
; 0,3 g kalsium klorida CaCl
2
; 0,2 g kalium klorida KCl
2
; dan 2,0 g natrium bikarbonat NaHCO
3
dalam sebagian aquadest dengan menggunakan labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas, sedangkan
natrium bikarbonat dilarutkan dalam air bebas CO
2
. Bahan-bahan tersebut lalu dicampur dan ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter, sehingga
diperoleh air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil.
5. Penetasan siste artemia
Siste artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar 5 permil dalam bak penetasan artemia yang disekat menjadi 2 bagian, bagian terang dan
bagian gelap, dengan lubang sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat siste artemia ditaburkan. Siste menetas setelah kira-kira 24 jam kemudian menjadi
larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva berumur 48 jam yang aktif inilah yang akan digunakan untuk
BST.
6. Penyiapan sampel uji toksisitas
Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dibuat seri konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml. Seri konsentrasi 50, 100, dan 200 µgml dibuat
dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan berkonsentrasi 10 mgml larutan A, sedangkan seri konsentrasi 400 dan 800
µgml dibuat dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
tembelekan berkonsentrasi 1 mgml larutan B. Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu dilakukan pengujian terhadap kelompok kontrol,
yaitu larutan kloroform yang tidak mengandung ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan. Dilakukan replikasi sebanyak 5 kali.
7. Uji toksisitas
Uji dilakukan dengan menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam. Sepuluh ekor larva artemia yang berumur 48 jam diambil secara random,
dimasukkan ke dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu dan air laut buatan sebanyak 3 ml yang telah divortex. Kemudian ditambah air laut
buatan sampai 5 ml dan 1 tetes ragi 1,5 mg5 ml sebagai makanan. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan tiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali
ulangan. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Selama 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk
mengetahui harga LC
50
Meyer et al., 1982.
8. Identifikasi kualitatif senyawa aktif dengan KLT
Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan larutan A ditotolkan pada plat KLT 3 totol. Plat KLT dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh
dengan fase gerak lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan. Untuk memastikan letak dan warna bercak sampel serta
pembandingnya maka dilakukan deteksi dengan menggunakan pereaksi semprot yang sesuai.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
a. flavonoid 1. Fase diam
: selulosa 2. Fase gerak : n-butanol:asam asetat:air 4:1:5 vv fase atas
3. Standar : rutin
4. Deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia dan dengan pereaksi AlCl
3
b. triterpenoid 1. Fase diam
: silika gel GF 254 MERCK 2. Fase gerak
: toluen:etil asetat 93:7 vv 3. Pembanding
: ekstrak etanol Liquiritiae Radix 4. Deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm, dan vanillin
asam sulfat pemanasan 100-110 °
C, 10 menit
F. Analisis Data
Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis probit SPSS untuk menghitung harga LC
50
. Jika pada kontrol ada larva artemia yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot Kumar, Prasad,
Singh, 2005.
100 100
× −
− =
kontrol kematian
kontrol kematian
perlakuan kematian
terkoreksi kematian
Kumar et al., 2005
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Tujuan dilakukan determinasi tanaman adalah untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan
di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan Van Steenis, 1981. Berdasarkan determinasi
yang telah dilakukan lampiran 1, diperoleh kesimpulan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah benar-benar tumbuhan Lantana camara L..
B. Pengumpulan Bahan dan Penyarian Zat Aktif
Daun tumbuhan tembelekan diperoleh di Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Tumbuhan yang telah dikumpulkan diambil daunnya. Daun
yang diambil merupakan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai. Pemilihan ini bertujuan agar daun yang digunakan memiliki umur yang relatif sama sehingga
kadar senyawa aktifnya tidak berbeda secara bermakna Anonim, 1985. Daun- daun tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir agar tanah dan pengotor
lainnya dapat terlepas. Kemudian daun dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam. Tujuan pengeringan secara tidak langsung
adalah agar senyawa aktif yang terdapat di dalam tanaman tidak rusak karena paparan panas, sedangkan tujuan pengeringan adalah untuk mempermudah
penyerbukan simplisia, menurunkan kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, meminimalkan reaksi enzimatis, dan untuk menjamin agar kualitasnya tetap baik
sehingga dapat disimpan dalam waktu ya ng cukup lama Anonim, 1986.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI