Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Data

21

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Brine Shrimp Lethality Test BST ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia merupakan jenis penelitian eksperimental murni denga n rancangan Posttest Only Control Group Design. Lokasi penelitian adalah laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas: konsentrasi ekstrak kloroform daun tumb uhan tembelekan, yaitu 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml yang diujikan pada larva artemia. b. Variabel tergantung: jumlah larva artemia yang mati akibat pemberian ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan berbagai konsentrasi. c. Variabel pengacau terkendali, yaitu: 1. Umur larva artemia, yaitu 48 jam 2. Lingkungan tempat percobaan yang meliputi: pH air laut buatan antara 7-8 dengan kadar garam 5 per mil, cahaya untuk mempercepat penetasan larva artemia dengan menggunakan sinar lampu 5 watt, serta suhu lingkungan yang optimal bagi kelangsungan hidup larva artemia yang berkisar antara 25-30°C. 3. Faktor jenis atau varietas tumbuhan tembelekan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22 4. Teknik dan lamanya penyarian daun tumbuhan tembelekan. d. Variabel pengacau tak terkendali: kondisi lingkungan tempat tumbuh tumbuhan tembelekan.

2. Definisi operasional

a. Median Lethal Concentration LC 50 adalah konsentrasi larutan senyawa uji yang menyebabkan kematian separuh dari hewan uji dengan perlakuan selama 24 jam dan merupakan data kuantitatif yang diperoleh pada uji BST, dinyatakan dalam µgml. b. Larva artemia yang mati adalah larva yang tidak menunjukkan adanya kehidupan yang ditandai dengan tidak adanya gerakan sekecil apa pun dari larva. c. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan adalah ekstrak kental atau kering yang dib uat dengan menyari daun tembelekan dalam pelarut kloroform dengan cara maserasi selama 48 jam. d. Larva artemia adalah larva yang telah berumur 48 jam hasil penetasan siste artemia.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

Bahan penelitian ini berupa daun tumbuhan tembelekan yang diperoleh dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006.

2. Bahan untuk ekstraksi

Bahan untuk ekstraksi adalah kloroform pro analysis p.a MERCK. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23

3. Bahan untuk KLT

Semua bahan untuk KLT berderajat p.a kecuali serbuk Liquiritiae Radix yang berderajat farmasetis. 1. Untuk uji flavonoid. Bahan yang digunakan antara lain selulosa MERCK, n-butanol, asam asetat, aquadest, ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, pembanding rutin 1, uap ammonia, dan pereaksi AlCl 3 . 2. Untuk uji triterpenoid. Bahan yang digunakan antara lain silika gel GF 254 MERCK, toluene, etil asetat, ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, ekstrak kloroform Liquiritiae Radix dan pereaksi semprot vanilin asam sulfat.

4. Bahan untuk pembuatan air laut buatan

Semua bahan kimia untuk pembuatan air laut buatan berderajat teknis. Bahan-bahan tersebut adalah kalium klorida, kalsium klorida, magnesium klorida, magnesium sulfat, natrium bikarbonat, natrium klorida, aquadest, aquadest bebas CO 2 , dan aquadest panas.

5. Bahan untuk uji toksisitas BST

a. Larva artemia yang berumur 48 jam merupakan hasil penetasan siste Artemia salina Viper Jeannie Hoo., LTD, China dalam air laut buatan berkadar 5 permil. b. Larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml. c. Air laut buatan berkadar 5 permil. d. Suspensi Sacharomyces cerevisiae ragi sebagai makanan bagi larva artemia. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24

D. Alat-alat Penelitian

1. Alat untuk ekstraksi

Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi antara lain: blender, shaker Innova 2100, gelas ukur Pyrex, Erlenmeyer Pyrex, gelas Beker Pyrex, sendok, pipet ukur, pipet volume, kertas saring, Vaccum Rotary Evaporator Janke Kunkel, Waterbath Memert, neraca analitik Mettler Toledo AB 204, batang pengaduk, dan cawan porselen.

2. Alat untuk uji BST

Alat-alat yang digunakan untuk uji BST antara lain: flakon, bak penetas artemia, mikropipet Socorex ISBA S.A, lampu 5 watt dop, aerator Niko NK 1200, pipet tetes, pipet khusus BST, neraca analitik Mettler Toledo AB 204, dan Vortek Dijkstra.

3. Alat untuk KLT

Alat-alat yang digunakan untuk KLT antara lain: pipet kapiler, bejana kromatografi, alat semprot, kertas saring, dan lampu UV 254 dan 365 nm.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan

Determinasi dilakukan untuk memastikan jenis tumbuhan tembelekan yang akan digunakan untuk penelitian. Determinasi tumbuhan tembelekan dilakukan di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan menurut Van Stenis 1981. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25

2. Pengumpulan bahan

Daun tumbuhan tembelekan dikumpulkan dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Daun tumbuhan tembelekan yang telah dikumpulkan diambil daunnya, dicuci dengan menggunakan air mengalir, dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam. Setelah kering kemudian diserbuk dengan cara diblender.

3. Pembuatan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan

Sebanyak 30 gram serbuk daun tumbuhan tembelekan ditimbang dan dimasukkan dalam Erlenmeyer dengan ditambah 225 ml kloroform. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil kemudian diletakkan pada shaker dengan laju konstan 120 rpm selama 24 jam lalu larutan disaring dengan kertas saring. Maserat ditampung dan disimpan pada suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 225 ml kloroform menggunakan shaker 120 rpm selama 24 jam, lalu disaring dan maserat ditampung untuk digabungkan dengan maserat hasil maserasi 24 jam pertama. Maserat yang terkumpul lalu dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator sampai kental volume kira-kira 13 nya. Setelah itu, dengan menggunakan cawan porselen yang sudah ditimbang terlebih dahulu, ekstrak diuapkan di atas waterbath dengan suhu 50 ° C dan dengan kipas angin sampai didapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering ini kemudian dibungkus rapat dan disimpan dalam eksikator. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26

4. Pembuatan air laut buatan

Air laut buatan diperoleh dengan cara melarutkan: 5,0 g natrium klorida NaCl; 1,3 g magnesium sulfat MgSO 4 ; 1,0 g magnesium klorida MgCl 2 ; 0,3 g kalsium klorida CaCl 2 ; 0,2 g kalium klorida KCl 2 ; dan 2,0 g natrium bikarbonat NaHCO 3 dalam sebagian aquadest dengan menggunakan labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas, sedangkan natrium bikarbonat dilarutkan dalam air bebas CO 2 . Bahan-bahan tersebut lalu dicampur dan ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter, sehingga diperoleh air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil.

5. Penetasan siste artemia

Siste artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar 5 permil dalam bak penetasan artemia yang disekat menjadi 2 bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan lubang sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat siste artemia ditaburkan. Siste menetas setelah kira-kira 24 jam kemudian menjadi larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva berumur 48 jam yang aktif inilah yang akan digunakan untuk BST.

6. Penyiapan sampel uji toksisitas

Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dibuat seri konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µgml. Seri konsentrasi 50, 100, dan 200 µgml dibuat dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan berkonsentrasi 10 mgml larutan A, sedangkan seri konsentrasi 400 dan 800 µgml dibuat dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 tembelekan berkonsentrasi 1 mgml larutan B. Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu dilakukan pengujian terhadap kelompok kontrol, yaitu larutan kloroform yang tidak mengandung ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan. Dilakukan replikasi sebanyak 5 kali.

7. Uji toksisitas

Uji dilakukan dengan menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam. Sepuluh ekor larva artemia yang berumur 48 jam diambil secara random, dimasukkan ke dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu dan air laut buatan sebanyak 3 ml yang telah divortex. Kemudian ditambah air laut buatan sampai 5 ml dan 1 tetes ragi 1,5 mg5 ml sebagai makanan. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan tiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali ulangan. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Selama 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC 50 Meyer et al., 1982.

8. Identifikasi kualitatif senyawa aktif dengan KLT

Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan larutan A ditotolkan pada plat KLT 3 totol. Plat KLT dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan fase gerak lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan. Untuk memastikan letak dan warna bercak sampel serta pembandingnya maka dilakukan deteksi dengan menggunakan pereaksi semprot yang sesuai. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 a. flavonoid 1. Fase diam : selulosa 2. Fase gerak : n-butanol:asam asetat:air 4:1:5 vv fase atas 3. Standar : rutin 4. Deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia dan dengan pereaksi AlCl 3 b. triterpenoid 1. Fase diam : silika gel GF 254 MERCK 2. Fase gerak : toluen:etil asetat 93:7 vv 3. Pembanding : ekstrak etanol Liquiritiae Radix 4. Deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm, dan vanillin asam sulfat pemanasan 100-110 ° C, 10 menit

F. Analisis Data

Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis probit SPSS untuk menghitung harga LC 50 . Jika pada kontrol ada larva artemia yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot Kumar, Prasad, Singh, 2005. 100 100 × − − = kontrol kematian kontrol kematian perlakuan kematian terkoreksi kematian Kumar et al., 2005 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Tujuan dilakukan determinasi tanaman adalah untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan Van Steenis, 1981. Berdasarkan determinasi yang telah dilakukan lampiran 1, diperoleh kesimpulan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah benar-benar tumbuhan Lantana camara L..

B. Pengumpulan Bahan dan Penyarian Zat Aktif

Daun tumbuhan tembelekan diperoleh di Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Tumbuhan yang telah dikumpulkan diambil daunnya. Daun yang diambil merupakan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai. Pemilihan ini bertujuan agar daun yang digunakan memiliki umur yang relatif sama sehingga kadar senyawa aktifnya tidak berbeda secara bermakna Anonim, 1985. Daun- daun tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir agar tanah dan pengotor lainnya dapat terlepas. Kemudian daun dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam. Tujuan pengeringan secara tidak langsung adalah agar senyawa aktif yang terdapat di dalam tanaman tidak rusak karena paparan panas, sedangkan tujuan pengeringan adalah untuk mempermudah penyerbukan simplisia, menurunkan kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, meminimalkan reaksi enzimatis, dan untuk menjamin agar kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu ya ng cukup lama Anonim, 1986. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI