Peralatan Bahan dan Alat .1 Hewan Percobaan
3.3 Metode 3.3.1 Reidentifikasi Vaksin AI H5N1
Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok diekstraksi dengan menggunakan pelarut lemak kloroform atau eter, disentrifugasi kemudian endapannya diambil untuk uji
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR Ditjennak 2007.
Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan metoda TRIZOL
R
LS Reagent Invitrogen sebagai berikut : sebanyak 250
μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan memakai vortex mixer.
Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar 25–30
o
C, kemudian ditambahkan 500
μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu
2–8
o
C selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan putih bening
diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl
isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya
disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8
o
C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut
ditambahkan 1000 μl ethanol 75 dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5
menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10
μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60
o
C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu – 20
o
C sampai dilakukan RT-PCR. Reverse transcription
adalah pembuatan cDNA yang bersifat komplementer dengan RNA virus, menggunakan enzim reverse transcriptase. Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction RT-PCR dilakukan dengan metoda Super Script
TM
III One- Step RT-PCR System with Platinum
R
Taq DNA Polymerase Invitrogen. Primer yang
digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 adalah menurut Lee dan Suarez 2004 dan primer N1 Tabel 4. Reaksi PCR PCR mix dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi
sebagai berikut : 25 l 2x reaction PCR mix , 2 l Platinum Taq, 5 l RNA template, 1 l Primer forward
10 µM, 1 l Primer reverse 10 µM dan 16 l ddH
2
O ultrapure H
2
O. Campuran tersebut dihomogenkan dengan vortex mixer, kemudian dimasukkan ke dalam
mesin thermocycle yang telah diprogram. Program RT-PCR adalah menurut Lee et al.
2001: cDNA synthesis 60
o
C selama 30 menit, predenaturasi 95
o
C selama 2 menit, selanjutnya 35 siklus terdiri dari denaturasi 95
o
C selama 40 detik, penempelan 50
o
–55
o
C selama 40 detik, ekstensi 72
o
C selama 1 menit dan post ekstensi 72
o
C selama 4 menit. Pita DNA spesifik hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel
agarose 2 .
Tabel 4 Primer Untuk mengamplifikasi Virus AI H5N1 ___________________________________________________________________
Primer Sekuen basa
Produk pb ___________________________________________________________________
1 H5N1-H5-forward: 5’AAA CAG AGA GGA AAT AAG TTG AAAA ATT’3 55
H5N1-H5-reverse: 5’AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC’3 2 H5N1-N1-forward GD: 5- TTG CTT GGT CAGG CAA GTG C
120 H5N1-N1-reverse Yong: 5- TGA TAGG TGT CTG TTA TTA TGC C
____________________________________________________________________
pb: pasangan basa
Elektroforesis produk amplifikasi PCR DNA dilakukan menggunakan ultrapure agarose
Invitrogen 2. Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE buffer, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Ethium
bromide ditambahkan ke dalam gel hangat selanjutnya gel dituangkan ke dalam dish
mupid sebanyak 50 ml kedalam dish yang besar dan dibiarkan pada suhu kamar
selama 15 menit. Sambil menunggu, sebanyak 250 ml TBE buffer dituangkan ke dalam mupid electrophoresis
. Gel yang beku diletakkan di dalam mupid elektroforesis dengan aliran listrik negatif mengalir ke positif. Sebanyak 2
μl loading dye BlueJuice Gel Loading
-Invitrogen dan 8 μl produk amplifikasi PCR dicampur dan dimasukkan ke
dalam lubang gel. Voltase yang digunakan sebesar 50 Volt selama 45 menit. Pita atau fragmen DNA yang teramplifikasi dilihat dibawah sinar ultaviolet.