Millipore-Montage, Polyethilenglycol 6000 Merck, Bovine Serum Albumin Sigma, Sodium Dodecyl Sulfate
Invitrogen, Acrylamide Invitrogen, Tris HCl Sigma, NN- methhylene bis acrilamide
Invitrogen, Amonium persulfat Sigma, Tetra Methyl Etilen Diamin
TEMEDInvitrogen, Methanol Sigma, Marker protein Invitrogen, Promega, Mercaptoethanol
Sigma, Tris Base Sigma, Natrium Sitrat Merck, Amonium Sulfat Sigma, Enzim pepsin Sigma, Diethylaminoethyl DEAE, Cellulose, Asam acetat
glacial Sigma, Comassie blue Sigma, Imunoglobulin G kontrol Promega,
Freund’s Complete Adjuvant
FCA dan Freund’s Incomplite Adjuvant FIASigma, alkohol 70, aquabidest, formaldehyde, Minimum Eagle Media Gibco, Fetal Bovine Serum
Gibco, Penicillin Streptomycin Gibco, Triptose Phosphate Broth TPBBD, L- Glutamin
Gibco, NaHCO
3
Merck dan Thioglycollate TGC Difco. Bahan lain adalah TAB SPF, biakan jaringan MDCK, isolat AI H5N1 strain
Legok 2003, isolat AI IPB 2005, isolat AI H5N1 IPB 2007, isolat AI H5N1 IPB 2008, isolat AI H5N1 IPB 2009, dan isolat AGooseBojonggentengIPB2-RS2006
Susanti 2008.
3.2.3 Peralatan
Peralatan yang digunakan adalah kandang marmut, kelinci dan ayam dan perlengkapan makan dan minum.
Peralatan lain adalah alat suntik 1 ml, 3 ml, 5 ml dan 10 ml, filter 0.45 µm dan 0.22 µm, tabung sentrifus, mikropipet single dan multichannel, tips, tabung ependorf
microtube, beker glass, rak tabung, gelas objek, microwave, microplate 96 lubang dengan dasar V Nunc, microplate 96 lubang steril dengan dasar datar Nunc, botol
biakan jaringan Nunc, botol duran, magnetic sitrer, stirer, vortex mixer, pipet Mohr 1ml, 2 ml, 5 ml dan 10 ml, perlengkapan uji agar gel presipitasi Agar Gel
Precipitation AGP, pH meter, mesin sentrifus, mesin thermocycle, gel elektrophoresis,
transluminator, spektrofotometer, inkubator telur, inkubator biakan jaringan, timbangan, penangas air, peralatan untuk Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel
Electrophoresis SDS-PAGE, conector, pelubang telur, thoma cythometerl, inverted
microscope , dan laminar air flow Biosafety Level II.
3.3 Metode 3.3.1 Reidentifikasi Vaksin AI H5N1
Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok diekstraksi dengan menggunakan pelarut lemak kloroform atau eter, disentrifugasi kemudian endapannya diambil untuk uji
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR Ditjennak 2007.
Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan metoda TRIZOL
R
LS Reagent Invitrogen sebagai berikut : sebanyak 250
μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan memakai vortex mixer.
Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar 25–30
o
C, kemudian ditambahkan 500
μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu
2–8
o
C selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan putih bening
diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl
isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya
disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8
o
C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut
ditambahkan 1000 μl ethanol 75 dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5
menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10
μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60
o
C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu – 20
o
C sampai dilakukan RT-PCR. Reverse transcription
adalah pembuatan cDNA yang bersifat komplementer dengan RNA virus, menggunakan enzim reverse transcriptase. Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction RT-PCR dilakukan dengan metoda Super Script
TM
III One- Step RT-PCR System with Platinum
R
Taq DNA Polymerase Invitrogen. Primer yang
digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 adalah menurut Lee dan Suarez 2004 dan primer N1 Tabel 4. Reaksi PCR PCR mix dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi
sebagai berikut : 25 l 2x reaction PCR mix , 2 l Platinum Taq, 5 l RNA template, 1 l Primer forward
10 µM, 1 l Primer reverse 10 µM dan 16 l ddH
2
O ultrapure H
2
O. Campuran tersebut dihomogenkan dengan vortex mixer, kemudian dimasukkan ke dalam
mesin thermocycle yang telah diprogram. Program RT-PCR adalah menurut Lee et al.
