42.22 10.56 Preparasi Kandidat Vaksin Avian Influenza H5Nl Menggunakan Prinsip Antibodi Anti-idiotipe

Pre 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 8 16 8 4 4 6.96 3 mgg pi 1 2 3 4 5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 8 8 16 8 8 8 16 16 8 8 GMT 4 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9.18 16 16 32 16 16

18.38 10.56

16 32 32 16 16 21.11 I = Kelompok Kontrol; II = Kelompok Ig G Kontrol; III = Kelompok Ab 2 ; IV = Kelompok Vaksin AI H5N1; mgg pi = minggu post imunisasi; GMT= Geometric Mean Titer Lampiran 8 Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe Ab 3 terhadap Isolat AGooseBojonggentengIPB2-RS2006 dengan Uji SN Waktu imunisasi I II III IV Pre 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 mgg pi 1 2 3 4 5 GMT 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 8 8 8 8 8 8 I = Kelompok Kontrol; II = Kelompok Ig G Kontrol; III = Kelompok Ab 2 ; IV = Kelompok Vaksin AI H5N1; mgg pi = minggu post imunisasi; GMT= Geometric Mean Titer Lampiran 9 Prosedur Polymerase Chain Reaction PCR Metode Konvensional 1. Isolasi RNA Metoda TRIZOL R LS Reagent – Invitrogen A. Bahan : - Vaksin AI H5N1 inaktif Strain Legok - TRIZOL R LS Reagent Invitrogen, Cat. No. 10296-010 100 ml - Chloroform MerckBDH K171412141 CHCl 3. - Isoprophil Alcohol Merck K28887934 = 2-Propanol H 3 CHCOHCH 3 - Ethanol 75 Merck K15920083 C2H5OH. 25 ml DEPC-Treated Water. 75 ml Ethanol. - Air suling bebas Rnase. - Diethylpyrocarbonate DEPC Invitrogen, Cat. No. 10813-012 B. Alat-alat : - MikropipetSingle pipette 1000 μl khusus RNA - MikropipetSingle pipette 200 μl khusus RNA - MikropipetSingle pipette 10-20 μl khusus RNA - Tips 1000 μl khusus RNA. - Tips 100-200 μl khusus RNA. - Tips 10 μl khusus RNA. - Vortex mixer. - Sentrifus dingin Tomy Max 150 - Microtube 1.8 ml khusus RNA, harus baru dan sudah diautoclave. - Penangas air 60 C. - Wadah berisi es - Tempat pembuangan tips - Biosafety Cabinet Level 2. - Sarung tangan. - Masker C. Prosedur : Sebanyak 250 μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar 25–30 o C, kemudian ditambahkan 500 μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8 o C selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan putih bening diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8 o C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut ditambahkan 1000 μl ethanol 75 dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5 menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10 μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60 o C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu –20 o C sampai dilakukan RT-PCR.

2. Amplifikasi PCR MIX

Metoda Super Script TM III One-Step RT-PCR System dengan Platinum R Taq DNA Polymerase Invitrogen, Cat. No. 12574-026 Primer : 1. H5 Invitrogen = 55 bp H5F: 5’AAA CAG AGA GGA AAT AAG TTG AAAA ATT’3 H5R: 5’AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC’3 2. N1 Eurogentec = 120 bp N1F: 5- TTG CTT GGT CAGG CAA GTG C N1R: 5- CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC A. Bahan-bahan : - Reaction PCR Mix - Super Script TM III Platinum Taq - RNA template extraction product with Trizol - Primer forward H5 dan N1 - Primer reserve H5 dan N1 - ddH 2 O - Mineral oil B. Alat-alat : - PCR tube 0.5 ml bebas RNA - Single pipette 1-10 μl - Single pipette 10-20 μl - Single pipette 10-100 μl - Tips 0.1-10 μl - Tips 10-20 μl - Tips 10-100 μl - Tempat pembuangan tips - Wadah berisi es - Sarung tangan - Masker - Mesin PCR C. Prosedur : Reaksi PCR PCR mix dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi 25 l 2x reaction PCR mix , 2 l Platinum Taq, 5 l RNA template, 1 l Primer forward 10 µM, 1 l Primer reverse 10 µM dan 16 l ddH 2 O ultrapure H 2 O. Campuran tersebut dihomogenkan, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram. Program RT-PCR adalah cDNA synthesis 60 o C selama 30 menit, predenaturasi 95 o C selama 2 menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi 95 o C selama 40 detik, penempelan 50 o – 55 o C selama 40 detik, ekstensi 72 o C selama 1 menit dan post ekstensi 72 o C selama 4 menit.

3. Elektrophoresis dan Visualisasi Produk Amplifikasi PCR A. Bahan-bahan:

1. Running Buffer → TBE Buffer pH 8.0-8.1 Invitrogen 2. Agarose Invitrogen. 2 : - Agarose 3 gr - TBE 150 ml Larutan dimasak dalam microwave sampai larutan bening. 3. Ethidium Bromide 4. BlueJuice TM Gel Loading Buffer Invitrogen, Cat. No. 10816-015 5. Marker Invitrogen, Cat. No. 15628-019- 100 bp DNA ladder; Invitrogen, Cat. No. 10416-014- 50 bp DNA ladder B. Alat-alat : - Erlenmeyer - Timbangan - Volumetric flask - pH meter - Mini gel Electrophoresis System Mupid 2 - Single pippette 1-10 μl - Single pippette 10-20 μl - Tips 1-10 μl - Tips 10-20 μl - Wadah gel - Parafilm - Transluminator C. Prosedur : Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE buffer, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Ethium bromide ditambahkan ke dalam gel hangat selanjutnya gel dituangkan ke dalam dish mupid ± 50 ml kedalam dish yang besar dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Sambil menunggu, sebanyak 250 ml TBE buffer dituangkan ke dalam mupid electrophoresis. Gel yang beku diletakkan di dalam mupid elektroforesis dengan aliran listrik negatif mengalir ke positif. Sebanyak 2 μl loading dye BlueJuice Gel Loading dan 8 μl produk amplifikasi PCR dicampur dan dimasukkan ke dalam lubang gel. Voltase yang digunakan sebesar 50 Volt selama 45 menit. Pita DNA yang teramplifikasi dilihat dibawah sinar ultraviolet Lampiran 10 Prosedur Uji Agar Gel Presipitasi Agar Gel Presipitation =AGP A. Bahan-bahan: - Agarose 0.4 gr - Poly Ethylene Glycol PEG 6000 1.2 gr - Na azide 0.1 0.04 gr - Larutkan dalam 25 ml PBS pH 7.4 dan 25 ml akuades pH 7.4.

B. Alat-alat:

- Gelas erlenmeyer - Gelas ukur - Gelas objek - Timbangan - Sendok - Mikrowave - Puncher - Pipet 10 ml - Mikropipet + tips

C. Prosedur:

Larutan agar dipanaskan dalam mikrowave sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Larutan sebanyak 3.75 ml dituangkan pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras, kemudian dibuat sumur-sumur dengan puncher. Antigen sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur tengah dan antibodi sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur disekelilingnya. Lampiran 11 Prosedur Uji Hambatan Hemaglutinasi Hemaglutination Inhibitiont = HI 1. Bahan –bahan : A. Alsever’s C 6 H 12 O 6 Merck Art. 8342 20,5 gr, C 6 H 5 Na 3 O 7 . 2H 2 O Merck Art. 6448 8 gr C 6 H 8 O 7 2H 2 O Merck Art. 244 0,55 gr NaCl Merck Art. 6404 4,20 gr, Ditambahkan dH 2 O 1000 ml. Stirer sampai larut, kemudian cek pH 6,1. Autoclave pada suhu 115 o C dengan tekanan 12,5 psi selama 15 menit. Alsever’s disimpan pada suhu 4 o C. B. Sel darah merah ayam 1 C. Phospate Buffer Saline PBS D. Antigen 4 HAU E. Kapas alkohol 2. Alat-alat: A. Syringe B. Tabung sentrifus C. Sentrifus D. Mikroplate 96 lubang dengan dasar V E. Mikropipet + tips 3. Prosedur Uji Hambatan Hemaglutinasi HI A. Pembuatan Sel Darah Merah Ayam SDM ayam 10 Ayam SPF diambil darahnya dari vena brachialis sayap dengan perbandingan 1:1 darah:alsever dalam syringe, kemudian dicampur merata, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifus dengan kecepatan 3000 g selama 5 menit. Pembuatan SDM ayam pekat dengan cara mencuci SDM ayam dengan PBS sebanyak 3 kali. Sel darah merah sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung 10 ml dan ditambahkan PBS, kemudian disentrifus dengan kecepatan 1000 g selama 10 menit, selanjutnya supernatan dibuang. B. Pembuatan Sel Darah Merah Ayam SDM ayam 1 10 ml Pembuatan SDM ayam 1 dengan cara SDM ayam pekat sebanyak 1000 µl dicampur dengan PBS 10 ml. Kocok perlahan hingga larut. C. Pembuatan Antigen 4 HAU Prosedur uji HA adalah sebagai berikut : Antigen H5N1 diencerkan secara seri dengan kelipatan dua. Pada pengujian ini menggunakan lempeng mikrotiter 96 lubang dengan dasar V. Pada lubang pertama dengan menggunakan pipet single channel 100 dimasukkan 25 µl antigen. Pada semua lubang dimasukkan larutan PBS, kemudian dilakukan pengenceran dengan menggunakan pipet multichanel 5 µl- 50 µl, pada lubang 11 dibuang 25 µl, lubang 12 sebagai kontrol sel darah merah. Sebanyak 50 µl sel darah merah ayam 1 dengan menggunakan pipet multichanel 5 µl- 50 µl dimasukkan ke dalam semua lubang kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit. Titer antigen 1 HAU adalah pengenceran terakhir yang dapat mengaglutinasi sel darah merah ayam. Tetapkan nilai 4 HAU untuk dipakai pada uji HI. D. Prosedur Uji HI Prosedur uji HI adalah sebagai berikut : Pada lubang pertama dengan menggunakan pipet single channel 100 µl dimasukkan 25 µl serum. Pada semua lubang dimasukkan pengencer Phospate Buffer SalinePBS, kemudian dilakukan pengenceran secara seri kelipatan dua sampai lubang 11, lubang 12 sebagai kontrol sel darah merah. Antigen AI H5N1 yang telah diencerkan hingga konsentrasi 4 HA Unit sebanyak 25 µl dimasukkan pada semua lubang dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl ditambahkan sel darah merah ayam 1 sebanyak 50 µl pada semua lubang dan selanjutnya diinkubasikan pada kamar selama 30 menit. Terbentuknya aglutinasi menunjukkan bahwa serum tersebut tidak mengandung antibodi terhadap v, sirus AI, sedangkan apabila tidak terjadi aglutinasi tetapi yang terjadi adalah pengendapan sel darah merah ayam, maka serum tersebut mengandung antibodi terhadap virus AI. Banyaknya antibodi dalam serum dinyatakan dalam titer yang dihitung sampai pengenceran keberapa terjadi pengendapan sel darah merah ayam. Satuannya adalah HI unit . E. Penghitungan Geometric Mean Titer GMT Brugh 1978: Log 2 GMT = Log2t1S1+log2t2S2+…. log2tnSn N Keterangan : N = Jumlah contoh serum yang diamati t = titer antibodi pada pengenceran tertinggi yang masih dapat menghambat aglutinasi sel darah merah S = Jumlah contoh serum yang bertiter t n = Sampel ke-n Lampiran 12 Prosedur Pemurnian Imunoglobulin G IgG

1. Bahan-bahan:

A. Montage Antibody purification kit spin column with Prosep A media Millipore. B. Serum

2. Alat- alat:

A. Tabung sentrifus B. Sentrifus C. Mikropipet + tips

3. Prosedur

Pemurnian Imunoglobulin G IgG dari serum marmut Ab 1 dan serum kelinci Ab 2 dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit spin column with Prosep A media Millipore. Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian dimasukkan kedalam spin kolom. Spin kolom dicuci dengan 10 ml binding buffer disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum di filter dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 um. Sampel serum dilarutkan dengan binding buffer menggunakan perbandingan 1:1 vv, lalu dimasukkan kedalam kolom spin dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Kolom spin dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer elusi langsung kedalam tube sentrifus berisi 1,3 ml buffer netral dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah yang ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG. Lampiran 13 Prosedur Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis SDS- PAGE

1. Persiapan reagen SDS PAGE

A. AcrylamideBis 30T,2.67 C AcrilamideBis 30T,2.67 C 146 gr NN Methylene-bis-acrylamide 4 gr Larutkan dalam akuabides sampai volume 500 ml, simpan pada suhu 4 o C dalam wadah gelap. Masa pakai 30 hari. B. 1.5 M Tris- HCl pH 8.8 Tris Base 54.25 gr Larutkan dalam akuabides sampai 150 ml, buat sampai pH 8.8 dengan Hcl kemudian tambahkan aquabides sampai volume 300 ml. C. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Tris base 6 gr Larutkan dalam akuabides sampai 60 ml, buat sampai pH 6.8 dengan HCl kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100 ml. D. 10 wv SDS Larutkan 10 gr SDS dalam 60 ml akuabides dengan stirer, kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100 ml. E. 10 wv Ammonium Persulfate Larutkan 10 gr ammonium persulfat dalam 100 ml akuabides. F. Sampel buffer Akuabides 3.0 ml 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 ml Glyserol 1.6 ml 10 SDS 1.6 ml ß-merkaptoetanol 0.4 ml 0.5 wv bromophenol blue dalam akuades 0.4 ml Encerkan sample dengan perbandingan 1:4. Panaskan pada 95 o C selama 4 menit. Catatan: Sampel dapat diganti dengan sampel buffer komersil dengan perbandingan 1:1. G. 5x Running buffer 1x = 25 mM Tris, 192mM glycine, 0.1 SDS pH 8.3 Tris Base 45 gr Glycine 216 gr SDS 15 gr Larutkan dalam 3 liter akuabides, simpan pada suhu 4 o C. Sebelum digunakan biarkan pada suhu ruang dan buat menjadi larutan 1x.

2. Persiapan Gel

Gel Pemisah 375 M Tris, pH 8.8 Gel Pengumpul 125 M Tris, pH

6.8 Monomer concentration

30T, 2.67C 12 4 AcrilamideBis 30 T, 2.67 C 2.4 ml 260 µl Akuabides 2 ml 1.22 ml 1.5 M Tris- HCl pH 8.8 1.5 ml - 0.5 M Tris-Hcl pH 6.8 - 0.5 ml 10 wv SDS 60 µl 20 µl 10 wv Ammonium Persulfate 30 µl 10 µl TEMED 3 µl 2 µl Catatan : Volume gel pemisah dan pengumpul dapat diperbesar dan diperkecil sesuai ukuran cetakan gel yang tersedia umumnya setiap merk elektrophoresis berbeda volume Dapat dibuat kelipatannya. Dalam penelitian ini akan digunakan elektrophoresis Sigma.

3. Persiapan Pewarnaan

Gel SDS diwarnai dengan metode pewarnaan Commasie Blue. A. Larutan Commasie Blue Larutkan 0.25 gr commasie brilliant blue dalam 125 ml methanol, 25 ml asam asetat glasial dan 100 ml akuabides. B. Larutan Pemucat Larutkan 100 ml methanol, 100 ml asam asetat glasial dan 800 ml akuabides.

4. Prosedur SDS PAGE

Penentuan berat molekul dianalisis dengan metode Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE Gordon 1983. Pengukuran berat molekul ini sesuai dengan teknik yang dilakukan oleh Laemmli 1970 dengan sistem discontinue menngunakan gel pemisah dengan konsentrasi 12 , gel pengumpul 4 , running buffer, larutan pewarna commasie brilliant blue dan larutan pemucat distaining solution. Pembuatan agar acrilamid dilakukan dengan bantuan dua lempeng kaca yang berukuran 18x15.5 cm Pharmacia-Biotech R yang telah dibersihkan dengan alcohol 70, pada kedua sisi tepi bagian dalam diberi spacer, kedua lempeng kaca dihimpitkan dan selanjutnya dijepit. Pada bagian atas lempeng kaca disisipkan sisir pembuat jalur dan kemudian diisi gel pemisah 12 poliakrilamid sampai 1 cm dibawah ujung sisir dengan bantuan mikropipet dan biarkan selama sekitar 30 menit kemudian diisi gel pengumpul 4 poliakrilamid hingga mencapai permukaan lempeng kaca. Sampel dilarutkan dengan larutan buffer sample perbandingan 1:1 dan campuran ini kemudian diinkubasi dalam penangas air 60 o C selama 5 menit sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel electrophoresis. Sebanyak 10 µl sample dimasukkan ke dalam masing-masing sumur, kemudian perangkat electrophoresis dijalankan dengan arus 50 mA dengan voltase 100 V selama kurang lebih 3 jam. Elektrophoresis berakhir apabila pewarna sample mencapai batas 0.5 cm dari bagian bawah gel. Setelah electrophoresis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan direndam dalam larutan pewarna commasie brilliant blue Sigma R Chemical Co. selama 45 menit pada suhu ruang sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel gel pada larutan pemucat methanol dan asam asetat sehingga gel berwarna bening atau pita-pita protein yang telah terbentuk terlihat jelas.