dengan kecepatan 10.000 g selama 30 menit. Larutan ini kemudian di desalting dengan Amicon Ultra 15
dengan kecepatan 4500 g selama 20 menit. Larutan ini kemudian di dialisis dalam PBS pH 8.0 selama 24 jam untuk menghilangkan garam yang terdapat
pada larutan protein. Proses dialisis ini akan menyebabkan molekul-molekul garam keluar melalui pori-pori tabung secara bertahap hingga konsentrasi garam di dalam dan di
luar tabung dialisis menjadi sama. Hasil dialisis inilah yang akan digunakan sebagai Ab
1
untuk mengimunisasi kelinci. Reidentifikasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE. Fragmen Fab
2
memiliki berat molekul 110 kDa, selanjutnya konsentrasi ditentukan dengan menggunakan
spektrofotometer ultra violet.
3.3.3 Produksi Antibodi Anti-Idiotipe Ab
2
Pada Kelinci
Antibodi anti-idiotipe Ab
2
disiapkan dengan cara menyuntik kelinci dengan Ab
1
Fab
2
. Produksi Ig G menggunakan 3 ekor kelinci New Zealand White berat 2.5 kg. Dua ekor kelinci diimunisasi dengan 500 µg Ab
1
H5N1 dalam Freund’s Complete Adjuvant
FCA secara subcutan dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Imunisasi ulangan dilakukan satu minggu berikutnya dengan menyuntikkan 500 µg Ab
1
dalam Freund’s Incomplete Adjuvant
FIA secara subcutan. Satu minggu kemudian serum dikoleksi dan identifikasi keberadaan Ab
2
H5N1 strain Legok dengan uji AGP. Berat molekul ditentukan dengan metode SDS-PAGE dan konsentrasinya dihitung dengan
spektofotometer ultra violet.
3.3.3.1 Pemurnian Imunoglobulin G Kelinci Anti-Idiotipe Ab
2
Pemurnian Imunoglobulin G IgG AI H5N1 dari serum kelinci Ab
2
dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit spin column with Prosep A
media Millipore. Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian
dimasukkan kedalam spin column. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring
dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan
dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 vv, lalu dimasukkan kedalam spin column
dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin column dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5
menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1.3 ml buffer
netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan
menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG.
Reidentifikasi IgG kelinci dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE Hames Rickwood 1987 dengan menggunakan
sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 . Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi
berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet.
3.3.4 Imunogenesitas “Kandidat Vaksin” Antibodi Anti-idiotipe
Imunisasi Antibodi Anti-idiotipe Ab
2
pada ayam dilakukan untuk mendeteksi terbentuknya antibodi terhadap Ab
2
. Antibodi yang diperoleh dari serum ayam merupakan antibodi anti anti-idiotipe Ab
3
. Antibodi ini diharapkan mempunyai karakteristik serologi sama dengan antibodi dari serum marmut Ab
1
, sehingga mampu bereaksi homolog dengan Ab
2
maupun dengan antigen virus AI. Imunisasi dilakukan sebagai berikut: sebanyak 20 ekor ayam dibagi 5 ekor
menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok I sebagai kontrol; kelompok II sebagai kelompok Ig G kelinci kontrol, kelompok III sebagai kelompok kandidat vaksin antibodi anti-
idiotipe dan kelompok IV sebagai kelompok vaksin AI H5N1. Kelompok kontrol adalah kelompok ayam yang tidak diberi perlakuan. Kelompok Ig G kelinci kontrol
adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ig G kelinci kontrol dalam FCA secara intramuscular. Kelompok antibodi anti-idiotipe adalah kelompok ayam yang
diimunisasi dengan 500 µg Ab
2
dalam FCA secara intramuscular. Kelompok vaksin AI H5N1 adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 1 dosis vaksin komersil AI H5N1
inaktif strain Legok secara intramuscular. Serum darah dikoleksi sebelum imunisasi preimunisasi dan tiap minggu post imunisasi selama 1 bulan. Pengukuran titer antibodi
dari imunisasi antibodi anti-idiotipe Ab
2
menggunakan uji HI dan uji serum netralisasi SN Ditjennak 2007; WHO 2002.
3.3.4.1 Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe Ab
3
dengan Uji HI
Persiapan untuk melakukan uji serologi antibodi anti anti-idiotipe Ab
3
dengan uji HI adalah dengan memproduksi antigen AI Lampiran 15 dari beberapa isolat, yaitu
isolat AI H5N1 IPB 2007, isolat AI H5N1 IPB 2008, dan isolat AI H5N1 IPB 2009, sedangkan antigen AI H5N1 strain Legok 2003 diperoleh dari Balitvet.
Uji serologi antibodi anti anti-idiotipe Ab
3
dengan uji HI sebagai berikut: sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam setiap lubang pada microplate 96 lubang,
kemudian ditambahkan 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl antigen
4 HAU pada semua lubang. Microplate diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, selanjutnya ditambahkan 25 µl sel darah merah ayam SPF 1 pada semua lubang.
Larutan tersebut diinkubasikan selama 40 menit pada suhu kamar. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menghambat aglutinasi sel
darah merah.
3.3.4.2 Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe Ab
3
dengan Uji SN
Persiapan untuk melakukan uji serologi anti anti-idiotipe Ab
3
dengan uji SN adalah dengan mempropagasi dan mengukur kandungan virus dari isolat AI H5N1 strain
Legok 2003, isolat AI H5N1 IPB 2005 dan isolat AGooseBojonggentengIPB2- RS2006 pada TAB dan sel MDCK Lampiran 14
Uji serum netralisasi dilakukan dengan menggunakan biakan sel MDCK. Sebanyak 25 µl medium dimasukkan ke dalam setiap lubang microplate 96 well,
kemudian 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl virus AI 100 TCID
50
pada semua lubang. Microplate diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
C dengan 5 CO
2
selama satu jam, selanjutnya ditambahkan dengan 100 µl sel MDCK 10
6
selml pada
