42.22 Preparasi Kandidat Vaksin Avian Influenza H5Nl Menggunakan Prinsip Antibodi Anti-idiotipe
Pre 1 2
3 4
5
GMT 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2
1 mgg pi 1 2
3 4
5
GMT 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2
2 mgg pi 1 2
3 4
5
GMT 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2
3 mgg pi 1 2
3 4
5
GMT 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 4
4 4
4 4
4
4 mgg pi 1 2
3 4
5
GMT 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 2
2 4
4 4
4 4
4 8
8 8
8 8
8
I = Kelompok Kontrol; II = Kelompok Ig G Kontrol; III = Kelompok Ab
2
; IV = Kelompok Vaksin AI H5N1; mgg pi = minggu post imunisasi; GMT= Geometric Mean Titer
Lampiran 9
Prosedur Polymerase Chain Reaction PCR Metode Konvensional
1. Isolasi RNA Metoda TRIZOL
R
LS Reagent – Invitrogen A. Bahan :
- Vaksin AI H5N1 inaktif Strain Legok
- TRIZOL
R
LS Reagent Invitrogen, Cat. No. 10296-010 100 ml
- Chloroform MerckBDH K171412141 CHCl
3.
- Isoprophil Alcohol Merck K28887934 = 2-Propanol H
3
CHCOHCH
3
- Ethanol
75 Merck K15920083 C2H5OH. 25 ml DEPC-Treated Water.
75 ml Ethanol. -
Air suling bebas Rnase. -
Diethylpyrocarbonate DEPC Invitrogen, Cat. No. 10813-012 B. Alat-alat :
- MikropipetSingle pipette 1000
μl khusus RNA -
MikropipetSingle pipette 200 μl khusus RNA
- MikropipetSingle pipette 10-20
μl khusus RNA -
Tips 1000 μl khusus RNA.
- Tips 100-200
μl khusus RNA. -
Tips 10 μl khusus RNA.
- Vortex mixer.
- Sentrifus dingin Tomy Max 150
- Microtube 1.8 ml khusus RNA, harus baru dan sudah diautoclave.
- Penangas air 60
C. -
Wadah berisi es -
Tempat pembuangan tips -
Biosafety Cabinet Level 2. -
Sarung tangan. -
Masker C. Prosedur :
Sebanyak 250 μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf
1.8 ml, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar 25–30
o
C, kemudian ditambahkan 500 μl chloroform. Tabung
tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8
o
C selama 15 menit. Sebanyak 500
μl fase cair pada supernatan putih bening diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500
μl isoprophil alcohol
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8
o
C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut
ditambahkan 1000 μl ethanol 75 dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5
menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10
μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60
o
C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu –20
o
C sampai dilakukan RT-PCR.