20 10
5
selml maka dilakukan pengenceran pada suspensi tersebut dengan menggunakan larutan pengencer NaCl 0,85 sampai didapatkan suspensi dengan konsentrasi 10
5
selml. Sebanyak 5 ml suspensi dengan konsentrasi 10
5
selml tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml susu UHT dan dikocok hingga homogen. Kemudian sampel susu UHT tersebut
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Untuk mengetahui jumlah mikroba akhir Salmonella
Typhimurium yang terkandung pada susu UHT, maka sampel susu UHT ditumbuhkan dan dihitung dengan metode konvensional pada media Xylose Lysine
Deoxycholate Agar XLDA yang diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Sebelumnya untuk mengetahui jumlah mikroba Salmonella Typhimurium natural pada susu UHT, maka
dilakukan penghitungan jumlah mikroba awal dengan menginokulasi 1 ml susu pada media XLDA dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3. IsolasiEkstraksi DNA Mikroba
Proses isolasiekstraksi DNA mikroba baik dari kultur murni maupun dari sampel susu UHT spike dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode pendidihan dan metode kit
komersial. Masing-masing metode dijelaskan pada sub bab di bawah ini.
a Isolasi DNA Salmonella Typhimurium dengan Metode
Pendidihan Rahayu et al. 2009
Satu ml suspensi kultur murni mikroba spesifik yang terdapat dalam media HIB atau sampel susu UHT spike dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Suspensi tersebut
disentrifus dalam mikrosentrifus selama 10 menit 14.000 rpm dengan suhu 20
o
C dengan tujuan untuk mengendapkan sel bakteri. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet
diresuspensi dengan 500 µl buffer TE lalu dihomogenkan dengan cara divortex. Suspensi tersebut disentrifus kembali pada mikrosentrifus selama 3 menit 14.000 rpm
pada suhu 20
o
C. Untuk sampel susu UHT spike, pencucian dengan buffer TE dan disentrifus dengan mikrosentrifus diulang kembali sebanyak satu kali. Pelet yang
dihasilkan diresuspensi dengan 100 µl Lisozim dan dihomogenisasi dengan cara divortex. Kemudian suspensi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.
Setelah diinkubasi, sebanyak 100 µl proteinase K ditambahkan ke dalam suspensi dan divortex sampai homogen. Selanjutnya suspensi diinkubasi pada suhu 55
o
C selama 1 jam dan dinkubasi kembali pada suhu 100
o
C selama 15 menit. Proses tersebut bertujuan untuk melisiskan sel bakteri dan menghilangkan protein-protein yang terkandung di
dalamnya. Penambahan buffer TE berfungsi untuk menjaga kestabilan DNA pada saat melisiskan sel. Suspensi yang telah diinkubasi didinginkan dalam es sampai membeku
dan di-thawing ketika selanjutnya akan disentrifus selama 5 menit 14.000 rpm pada suhu 20
o
C. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan pada tabung mikrosentrifus baru, disimpan sebagai isolat DNA pada suhu -20
o
C. Diagram alir proses ini dapat dilihat pada Lampiran 3.
Kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada spektrofotometer. Teknis pengukurannya adalah dengan membandingkan nilai
absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm A260A280. Isolat DNA dikatakan murni jika rasio diantara kedua nilai absorbansi tersebut berada pada selang
1,8 hingga 2,0 Nolan et al. 2007
21
b Isolasi DNA Salmonella Typhimurium dengan Kit Komersial
Berdasarkan QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit Handbook dengan
modifikasi Bioteknologi PROM
Tahapan proses dengan menggunakan kit komersial dilakukan sesuai dengan anjuran dari produsen yang bersangkutan, salah satunya berdasarkan protokolhandbook
yang dikeluarkan oleh Qiagen untuk penggunaan QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit dalam mengisolasimengekstraksi DNA mikroba. Kit tersebut terdiri dari empat jenis buffer
AW1, AW2, AE, dan AL, collection tube, dan kolom mini dimana di dalamnya terdapat filter putih. Di bawah ini Gambar 9. merupakan gambar kit komersial yang
digunakan pada penelitian ini.
Gambar 9. Kit komersial QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit Qiagen Proses isolasiekstraksi DNA dilakukan dengan penambahan buffer AL yang
dilakukan setelah penambahan proteinase K dimana bersama-sama dengan proteinase K berfungsi untuk melisiskan sel bakteri sehingga dinding sel bakteri rusak. Supernatan
yang dihasilkan dari proses sentrifugasi suspensi tersebut dimasukkan ke dalam kolom mini berfilter sehingga DNA tersangkutterikat di dalamnya. Penambahan buffer AW1
dan buffer AW2 yang dilakukan setelahnya kedalam kolom mini berfilter yang berfungsi untuk pencucian dimana proses pencucian tersebut dapat meningkatkan kemurnian DNA
nantinya serta meyakinkan penghilangan kontaminan secara keseluruhan dari proses tersebut tanpa mempengaruhi pengikatan DNA pada filter.
Penambahan buffer AE ke dalam kolom mini dan dilakukan proses sentrifugasi setelah proses pencucian berfungsi untuk mengelusi DNA dari filter dan juga berfungsi
dalam penyimpanan purifikasi DNA. Supernatan yang dihasilkan merupakan isolat DNA yang kemudian disimpan di dalam freezer suhu -20
o
C. Buffer AE yang digunakan mengandung 10 mM Tris.Cl; 0,5 mM EDTA pH 9,0 dimana pH yang basa dapat
menghindari DNA dari degradasi karena hidrolisis asam. Teknis pengisolasian DNA dengan kit komersial pertama-tama adalah satu ml
suspensi kultur murni mikroba spesifik yang terdapat dalam media HIB atau sampel susu UHT dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan dengan 1 ml
CTAB sebagai suatu modifikasi metode dari prosedur yang ditunjukkan pada handbook produsen kit, kemudian divortex hingga homogen. Suspensi tersebut disentrifus selama 1
menit dengan kecepatan 13000 rpm dan supernatan yang dihasilkan dibuang sehingga menyisakan pelet pada tabung mikrosentrifus. Jika tidak dihasilkan pelet, maka suspensi
disisakan sebanyak 200 µl supernatan pada tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan proteinase K sebanyak 30 µl ke dalam tabung mikrosentrifus, dan
22 dihomogenkan dengan vortex kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65
o
C. Setelah itu, ditambahkan buffer AL sebanyak 300 µl dan dihomogenkan dengan vortex.
Suspensi diinkubasi selama 10 menit di dalam water bath pada suhu 65
o
C. Setelah itu, ditambahkan 500 µl etanol 96-100, dihomogenkan dengan vortex dan disentrifus
selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom mini yang sudah dipasang pada collection tube, kemudian
disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl buffer AW1 ditambahkan ke dalam kolom mini yang masih terpasang pada collection tube dan disentrifus 8000 rpm
selama 1 menit. Tahap selanjutnya adalah kolom mini dipindahkan ke dalam collection tube yang
baru dan ditambahkan dengan 500 µl buffer AW2 ke dalam kolom mini, kemudian disentrifus 13000 rpm selama 3 menit. Kolom mini dipindahkan kembali ke dalam
collection tube dan disentrifus kembali selama 1 menit 13000 rpm. Kolom mini
dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril dan ditambahkan ke dalamnya sebanyak 80 µl buffer AE yang kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit.
Supernatan yang diperoleh pada tabung mikrosentrifus merupakan isolat DNA yang akan digunakan pada tahap selanjutnya dan isolat tersebut disimpan pada freezer dengan
sehu 20
o
C. Diagram alir proses ini dapat dilihat pada Lampiran 4. Kemudian kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada
spektrofotometer. Gambar penggunaan kolom mini dan collection tube dapat dilihat pada gambar berikut ini Gambar 10..
a b
Gambar 10. Proses isolasiekstraksi DNA dengan menggunakan metode kit
komersial, a penambahan buffer AW1 ke dalam kolom mini, b hasil sentrifugasi setelah penambahan AW1 dan supernatan yang
terdapat di bawah dibuang untuk selanjutnya filter dicuci kembali dengan buffer AW2.
4. Pengujian Salmonella Typhimurium dengan Real-Time PCR
