9 Secara prinsip, baik real-time PCR maupun PCR konvensional merupakan proses yang dilakukan
berulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap utama Pestana et al. 2010. Berikut adalah tiga tahap utama kerja PCR dalam satu siklus, ketiga tahap utama dalam proses
amplifikasi tersebut dapat dilihat lebih jelas pada Gambar 2 berikut ini.
Gambar 2. Tahapan amplifikasi dalam PCR Polymerase Chain Reaction Anonim 2009.
1. Tahap peleburan melting atau denaturasi.
Tahap ini berlangsung pada suhu tinggi, 94–96°C ikatan hidrogen DNA terputus denaturasi dan DNA utas ganda menjadi utas tunggal. Biasanya pada siklus awal PCR, tahap ini dilakukan
lebih lama 5 menit untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template patokan bagi primer. Umumnya, waktudurasi yang
dibutuhkan untuk tahap ini yaitu selama 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing.
Primer menempel pada bagian Template DNA yang komplementer urutan basanya. Tahap ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Umumnya, waktudurasi yang dibutuhkan untuk tahap ini yaitu selama 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan extension atau elongasi.
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis enzim DNA polimerase yang dipakai. Karena suhu dinaikkan ke dalam kisaran suhu optimum kerja enzim DNA polimerase. Dengan Taq
polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 70-76°C. Pada tahap ini DNA polimerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka
akan dipasang dNTP, begitu seterusnya pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu
10 ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, misalnya adalah 1 menit untuk
setiap 1000 bp. Selain ketiga proses tersebut umumnya tahap kerja PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan
berikut:
1. Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktivasi DNA Polimerase jenis hot-startaktif jika dipanaskan terlebih dahulu.
2. Final Elongasi
Umumnya dilakukan pada suhu optimum enzim 70-72
o
C. Tahap ini dilakukan selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. Proses amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycler yang dapat
menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya untuk melakukan proses tersebut digunakannya tiga penangas air water bath untuk melakukan
melting , annealing dan extention secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya
menggunakan tangan. Tetapi sekarang mesin thermal cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Secara teoritis, PCR dapat mengamplifikasi satu salinan DNA menjadi satu juta kali dalam waktu kurang dari 2 jam Gambar 3. maka berpotensi untuk mengurangi bahkan menghilangkan kebutuhan
untuk pengayaan kultur, namun kehadiran inhibitor dalam pangan dan dalam berbagai media kultur dapat mencegah terikatnya primer dan mengurangi efisiensi amplifikasi sehingga sangat sensitif
dicapai dengan PCR dan kultur murni sering berkurang bila menguji pangan. Oleh karena itu, beberapa pengayaan kultur diperlukan sebelum dilakukannya analisis.
Gambar 3. Jumlah DNA yang dihasilkan dari proses amplifikasi Anonim 2009 Komponen lain yang dibutuhkan untuk pengujian ini selain template DNA yang akan digandakan
dan enzim DNA polimerase, diantaranya adalah:
1. Primer
