23 reverse
dan forward primer InvA pada konsentrasi tertentu. Volume master mix keseluruhan untuk pengujian satu jenis template DNA adalah 18 µl. Bahan-bahan untuk
membuat master mix tersebut dicampur dalam satu tabung mikrosentrifus 2 ml dan dihomogenkan dengan vortex. Untuk melakukan pengujian beberapa jenis template
DNA, maka volume masing-masing bahan dikali dengan banyaknya jenis template DNA yang akan diuji pada real-time PCR dan dicampur di dalam tabung mikrosentrifus.
Kemudian masing-masing 18 µl campuran master mix yang telah dibuat pada tabung mikrosentrifus tersebut diambil dan dimasukkan kedalam setiap well yang kemudian
ditambahkan dengan 2 µl template DNA yang selanjutnya dihomogenkan pada MixMate PCR 96 dan dimasukkan pada alat real-time PCR.
b Amplifikasi dengan real-time PCR
Masing-masing sebanyak 18 µl master mix dan 2 µl templateisolat DNA yang telah dibuat dimasukkan ke dalam setiap well pada plate 96 Well Reaction. Kemudian well
ditutup dengan PCR Sealer
TM
Microseal
®
‘B’ Film dan dihomogenkan dengan
menggunakan MixMate PCR 96. Well dimasukkan ke dalam real-time PCR yang telah diatur dengan protokol PCR tertentu. Protokol PCR yang digunakan adalah pre-
denaturasi pada suhu 95
o
C selama 1 menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada suhu 95
o
C selama 30 detik dan annealing pada suhu 58.1
o
C selama 1 menit. Primer elongasi dilakukan pada suhu 72
o
C selama 1 menit 30 detik dan final elongasi selama 10 menit pada suhu 72
o
C. Analisis melting curve dari produk akhir PCR dilakukan sebanyak 81 siklus pada suhu 55
o
C selama 10 detik. Kemudian dilakukan running dengan real-time PCR.
5. Penentuan Konsentrasi Primer
Penentuan konsentrasi primer pada penelitian ini dilakukan dengan cara menguji primer dengan konsetrasi 0,0125; 0,025; dan 0,125 µM pada sampel kultur murni Salmonella
Typhimurium, menguji primer dengan konsentrasi 0,025 dan 0,125 µM untuk sampel suspensi 10
3
selml Salmonella Typhimurium dan sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium ke dalam real-time PCR dengan melalui dua tahap yang telah dijelaskan pada
sub bab sebelumnya. Kemudian dipilih konsentrasi primer yang sesuaitepat. Konsentrasi primer yang sesuaitepat adalah konsentrasi primer yang menghasilkan nilai Ct yang paling
rendah dan tanpa menghasilkan atau seminimal mungkin menghasilkan primer-dimer pada kurva puncak pelelehan Pestana et al. 2010.
6. Penentuan Spesifisitas Primer Ahmed et al. 2009
Isolat DNA kultur murni Salmonella Typhimurium sebagai kontrol positif dan isolat DNA Shigella sonnei sebagai kontrol negatif diuji dengan real-time PCR. Pengujian dengan
real-time PCR telah dijelaskan pada sub bab sebelumnya. Penentuan spesifisitas dilakukan
dengan menggunakan primer InvA forward dan reverse yang telah dianalisis dengan Basic Local Alignment Search Tool
NCBI 2011 dimana sekuen oligonukleotida primer yang digunakan tersebut telah spesifik untuk Salmonella dan tidak sesuai dengan sekuen gen pada
patogen tertentu yang biasa terdapat pada susu. Kemudian setelah pengujian dengan real- time
PCR selesai, dilakukan analisis terhadap kurva puncak pelelehan melt peak curve dan kurva amplifikasi yang dihasilkan.
Jika primer yang digunakan spesifik untuk Salmonella Typhimurium, maka Shigella sonnei tidak akan teramplifikasi dan tidak akan menghasilkan
24 nilai Tm pada melt peak curve sedangkan Salmonella Typhimurium akan teramplifikasi dan
menghasilkan nilai Tm.
7. Pengkuantifikasian Salmonella Typhimurium pada Sampel Pangan
Proses pengkuantifikasian dilakukan dengan membuat kurva standar yang menghubungkan nilai Ct yang diperoleh dengan real-time PCR pada sumbu-y dan log
konsentrasi mikroba pada sumbu-x. Kurva standar dibuat dengan mengencerkan 100 µl kultur murni Salmonella Typhimurium ke dalam 9 ml larutan pengencer NaCl 0,85.
Suspensi tersebut dihitung kandungan sel dalam setiap ml pengencer dengan hitungan mikroskopi pada petroff-hausser. Setelah diperoleh sejumlah 10
8
selml dalam suspensi, maka dilakukan pengenceran hingga 10
3
selml. Kemudian dilakukan isolasi DNA dan pengujian dengan real-time PCR sampai diperoleh nilai Ct dan kurva standar yang
menghasilkan persamaan garis dengan efisiensi 96-110; dan slope -3,1 hingga -3,6 Pestana et al. 2010. Efisiensi merupakan faktor penting untuk setiap metode kuantitatif
PCR yang reliable Siebert 1999. Efisiensi amplifikasi dapat dihitung dengan menggunakan persamaan:
E = [10
-1slope
-1] x 100 Nilai Threshold Cycle Ct dari hasil pengujian sejumlah 10
5
selml Salmonella Typhimurium pada sampel susu spike dimasukkan ke dalam persamaan garis yang diperoleh.
Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui nilai konsentrasi Salmonella Typhimurium yang terdapat pada susu berdasarkan pengujian dengan real-time PCR. Nilai konsentrasi hasil
pengujian dengan real-time PCR tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai konsentrasi yang sesungguhnya dimana dihitung dengan petroff-hausser dan dengan metode
konvensional pada media XLDA.
25
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kultur Murni Hasil Pengecekan Kemurnian
Hasil goresan kuadran kultur murni ke dalam media Xylose Lysine Deoxycholate Agar XLDA menghasilkan koloni Salmonella Typhimurium berwarna merah muda dengan inti hitam di tengahnya
dimana hal tersebut sesuai dengan yang dijelaskan pada Bacteriological Analytical Manual mengenai Salmonella
Andrews dan Hammack 2011. Sedangkan Shigella sonnei membentuk koloni merah muda tanpa ada inti hitam Health Protection Agency 2007. Hasil pengisolasian Salmonella
Typhimurium dan Shigella sonnei dapat dilihat pada Gambar 11. di bawah ini. a
Salmonella Typhimurium b
Shigella sonnei Gambar 11. Isolasi bakteri a Salmonella Typhimurium dan b Shigella sonnei pada media
XLDA Masing-masing satu koloni spesifik tersebut kemudian diisolasi dalam Heart Infusion Broth dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C sebagai kultur murni mikroba spesifik Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei yang selanjutnya digunakan dalam proses isolasiekstraksi DNA
dan juga diinokulasi ke dalam sampel pangan susu UHT sampel susu UHT spike. Penelitian yang dilakukan Omiccioli et al. 2009 dan Hadjinicolaut et al. 2009 juga menggunakan XLDA dalam
tahap pengayaan mengkulturkan mikroba.
