14 Salmonella
dapat dengan mudah diisolasidiekstraksi dengan menggunakan metode pendidihan mendidihkan sel bakteri di dalam air Lee et al. 2006.
Tahap isolasi DNA dengan metode pendidihan dilakukan setelah tahap enrichment pada kultur murni maupun pada sampel pangan. Tahap enrichment ini berfungsi untuk menyembuhkan sel
mikroba yang rusak maupun memperbanyak mikroba agar memberi keyakinan bahwa mikroba yang diisolasi adalah mikroba hidup. Selain itu juga untuk mengencerkan komponen inhibitor PCR yang
terdapat pada matriks sampel Rådström et al. 2004. Bahan yang pertama kali digunakan pada metode pendidihan adalah buffer TE dimana
mengandung Tris HCl 1 M pH 8,0 dan EDTA 0,5 M yang dicampur dengan pelet yang dihasilkan setelah sentrifugasi sampel. Proses sentrifugasi dan resuspensi pelet yang dihasilkan dengan buffer TE
secara berulang berfungsi untuk mencuci sampel kultur murnisampel spike dari inhibitor-inhibitor yang terkandung di dalamnya yang dapat mengganggu tahap amplifikasi DNA nantinya Lee at al.
2006. Selain itu buffer TE juga berfungsi untuk menjaga kestabilan DNA agar tidak terdegradasi ketika pelisisan sel terjadi.
Kemudian bahan berikutnya adalah penambahan lisozim ke dalam pelet bersamaan dengan ditambahkannya buffer TE. Lisozim berfungsi untuk melisiskan dinding sel bakteri dimana lisozim
dapat merusak membran luar sel bakteri. Aktivitas lisozim efektif pada suhu ruang. Kemudian pada metode pendidihan juga ditambahkan proteinase K. Proteinase K merupakan enzim proteolitik yang
digunakan untuk menghilangkan protein. Protein merupakan salah satu inhibitor dalam proses amplifikasi DNA. Suhu optimum aktivitas enzim proteinase K adalah 55-60
o
C selama 1 jam. Semakin lama inkubasi, maka daya recovery DNA semakin baik Sambrook et al. 1989.
Pendidihan di dalam air yang bersuhu 100
o
C berfungsi untuk menginaktivasi enzim proteinase K dan enzim nuklease atau DNAse dimana dapat mencerna asam nukleat dan menyebabkan penurunan
kualitas maupun kuantitas DNA selama penyimpanan. Pendidihan dengan pemanasan 100
o
C juga dapat mempercepat lisis dinding sel bakteri sehingga DNA dapat diekstraksi sekaligus mempermudah
proses denaturasi rantai DNA ketika dilakukan amplifikasi dengan PCR. Selain itu pendidihan juga dapat berfungsi mendenaturasi protein-protein inhibitor. Proses pendidihan tidak dapat mendenaturasi
DNA plasmid karena secara topologi intertwined Sambrook et al. 1989, namun dapat mendenaturasi DNA kromosomal.
Pendinginan segera dilakukan di dalam freezer setelah dilakukannya pendidihan agar DNA kromosomal dapat terenaturasi. Proses pendinginan ini juga menyebabkan debris sel, protein-protein
inhibitor dan DNA plasmid mengendap. DNA kromosomal akan larut dalam supernatan sedangkan debris sel, protein inhibitor, dan DNA plasmid akan terendapkan pada pelet setelah proses sentrifugasi
dimana dilakukan setelah proses pendinginan tadi. Dan supernatan yang dihasilkan tersebut diambil sebagai isolat DNA yang akan digunakan pada tahap amplifikasi selanjutnya.
Setelah persiapan isolat DNA selesai, maka dilakukan tahap amplifikasi yang dijalankan dalam thermal cycler
dan dihasilkanditampilkan dalam bentuk grafik pada layar komputer dengan software yang aplikabel terhadap thermal cycler, contohnya adalah software IQ-5 Bio-Rad. Grafik-grafik
yang diperoleh berupa grafik amplifikasi, kurva standar, kurva pelelehan melt curve dan kurva puncak pelelehan melt peak curve. Grafik tersebut digunakan untuk mengevaluasi kinerja
amplifikasi real-time PCR.
1. Kurva Amplifikasi
Kurva amplifikasi terbentuk sejak proses amplifikasi dimulai. Kurva ini berfungsi untuk menentukan apakah dalam thermal cycler terjadi amplifikasi atau tidak. Kurva amplifikasi dapat
dilihat pada Gambar 5. berikut ini.
15 Gambar 5. Grafik sigmoid proses amplifikasi dengan real-time PCR Pestana et al. 2010
Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas fuoresen, semakin banyak produk amplifikasi yang dihasilkan, semakin besar akumulasi fluoresen yang terbaca. Peningkatan fuoresen tersebut
ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid, seperti yang tergambar pada Gambar 5. garis hijau.
Grafik sigmoid akan berpotongan dengan baseline threshold yang telah ditentukan secara otomatis oleh program. Titik perpotongan antara grafik sigmoid dan baseline threshold jika
direfleksikan pada sumbu-x Cycle adalah threshold cycle Ct bagi sampel yang diamplifikasi. Nilai Ct adalah siklus di atas noise dimana akumulasi produk senilai 2
n
, n adalah jumlah pengulangan siklus amplifikasi terbaca pertama kali pada fase eksponensial. Fase eksponensial
berakhir menjadi fase plato saat pereaksi dalam campuran reaksi PCR sudah habis. Nilai Ct digunakan dalam kurva standar
sebagai fungsi terhadap log konsentrasi bakteri.
2. Melt Curve dan Melt Peak Curve
Setelah pengujian dengan real-time PCR selesai, thermo cycler dapat disesuaikan untuk menghasilkan kurva pelelehan melt curve dan kurva puncak pelelehan melt peak curve dengan
meningkatkan suhunya sedikit demi sedikit hingga mencapai titik pelelehan dimana DNA untai
ganda menjadi DNA untai tunggal dan kemudian mengukur perubahan fluoresen yang dihasilkan.
Pada titik pelelehan, untai ganda DNA terpisah dan sinyal fluoresen pun turun. Kurva pelelehan menghubungkan laju perubahan Relative Fluorescence Unit RFU per waktu T -dRFUdT
pada sumbu-y dengan suhu pada sumbu-x, kurva tersebut akan menunjukkan suhu pelelehan Tm. Suhu pelelehan merupakan suhu dimana 50 amplikon DNA untai ganda terpisah menjadi
dua untai tunggal. Puncak kurva pada melt peak curve merupakan nilai Tm amplikon, jika nilainya ditarik
menuju sumbu-x. Suhu Pelelehanmelting temperature Tm tergantung pada komposisi dasar dari produk yang terbentuk. Semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai
suhu pelelehan Tm yang sama kecuali jika terdapat adanya kontaminasi, mispriming, atau primer-dimer Pestana et al. 2010. Amplikon yang berasal dari DNA target yang sama akan
memiliki nilai Tm yang sama, ditunjukkan dengan puncak pada titik suhu yang sama. Melt peak curve
mampu menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik. Produk non-spesifik akan membentuk puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon produk spesifik atau melt peak
curve dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu. Bentuk kurva pelelehan dan kurva puncak
pelelehan dapat dilihat pada Gambar 6. berikut ini.
16 Gambar 6. Kurva pelelehanmelt curve kiri dan kurva puncak pelelehanmelt peak curve
kanan Hoffman et al. 2007 Setelah proses amplifikasi, jika molekul PCR yang terbentuk memiliki panjang yang sama
maka akan terbentuk single curve satu puncak dan satu nilai Tm, namun jika lebih dari satu produk PCR yang dihasilkan yang tidak homogen, maka akan terbentukteramati beberapa
transisi termal terbentuk lebih dari satu puncaknilai Tm. Jika hal tersebut terjadi, perlu dibuktikan dengan elektroforesis gel untuk meyakinkan bahwa terdapat adanya lebih dari satu
jenis DNAproduk PCR yang teramplifikasi Gambar 7..
Gambar 7. Analisis kurva pelelehan melt curve, A. Dua jenis puncak yang dihasilkan mengindikasikan nilai Tm dari dua jenis produk PCR, B. Analisis elektroforesis
gel pada produk PCR dari hasil yang terbentuk pada kurva A. Kedua jenis produk PCR tersebut dibuktikan dengan terpisahnyadiperolehnya dua pita dalam satu
garis pada gel Pestana et al. 2010.
17
II. METODOLOGI PENELITIAN
