32 dan konsentrasi primer yang tepat pada penelitian ini yaitu sebesar 0,125 µM dimana telah masuk
pada selang konsentrasi primer yang sesuai jika pengujian dengan real-time PCR menggunakan SYBR
®
green I sebagai bahan pendar yaitu antara 0,05 hingga 0,3 µM Pestana et al. 2010. Penelitian Shanmugasundaram et al. 2009 dimana menggunakan reverse dan forward primer
dengan urutan nukleotida yang sama, menggunakan sebanyak 0,15 µM primer pada pengujian dengan real-time
PCR. Hal tersebut tidak berbeda jauh dengan konsentrasi primer yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebesar 0,125 µM.
E. Hasil Penentuan Spesifisitas Primer
Reverse dan forward primer yang digunakan untuk mendeteksi gen target InvA pada Salmonella
Typhimurium diperkirakan berukuran 211 bp. Kedua jenis primer tersebut telah digunakan pada penelitian yang dilakukan Shanmugasundaram et al. pada tahun 2009. Primer tersebut kemudian
dianalisis dengan menggunakan Basic Local Alignment Search Tool NCBI 2011 dan hasil analisisnya dapat dilihat pada Lampiran 13. Untuk lebih meyakinkan bahwa kedua primer tersebut
spesifik terhadap Salmonella Typhimurium maka dilakukan pengujian Salmonella Typhimurium sebagai kontrol positif dan Shigella sonnei sebagai kontrol negatif dengan menggunakan real-time
PCR. Hasil penentuan spesifisitas primer dengan menggunakan real-time PCR dapat dilihat pada kurva amplifikasi dan kurva puncak pelelehan pada Gambar 12. dan Gambar 13. berikut ini.
Gambar 13. Kurva amplifikasi uji spesifisitas primer
Gambar 14. Kurva puncak pelelehan melt peak curve uji spesifisitas primer
Salmonella Typhimurium
Shig
ella sonnei
Ct
Salmonella Typhimurium
Shigella sonnei
33 Kurva amplifikasi yang dihasilkan oleh real-time PCR menunjukkan bahwa kontrol negatif tidak
teramplifikasi dan bakteri uji teramplifikasi dengan nilai Threshold Cycle Ct sebesar 12,37. Hal tersebut menandakan bahwa primer yang digunakan spesifik untuk Salmonella. Proses amplifikasi
tersebut mencirikan bahwa forward dan reverse primer yang ditambahkan dapat berikatan dan bereplikasi dengan sejumlah sekuen nukleotida di dalam gen target InvA yang hanya terdapat pada
Salmonella khususnya serovar Typhimurium.
Selain menganalisis kurva amplifikasi amplification curve, pengujian spesifisitas primer juga dilakukan dengan menganalisis kurva puncak pelelehan melt peak curve dengan melihat titik
puncak pelelehan melt peak dan nilai Tm Melting Temperature yang dihasilkan pada kurva tersebut.
Kurva puncak pelelehan menunjukkan bahwa kontrol positif Salmonella Typhimurium hanya menghasilkan satu puncak. Hal tersebut menunjukkan bahwa pada pengujian tersebut tidak terjadi
mispriming yang artinya primer yang digunakan spesifik dan tidak mengamplifikasi gen lain selain
gen target. Nilai Tm yang dihasilkan sebesar 84,50
o
C. Nilai tersebut dapat menjadi ciri khusus bagi Salmonella
Typhimurium pada pengujian selanjutnya. Selain itu kurva tersebut juga menunjukkan bahwa kultur murni Shigella sonnei tidak menghasilkan puncak dan nilai Tm yang menandakan
bahwa primer tidak dapat mendeteksi bakteri lain selain Salmonella khususnya serovar Typhimurium. Shanmugasundaram et al. 2009 dalam penelitiannya dimana menggunakan reverse dan forward
primer InvA dengan urutan nukleotida yang sama menunjukkan hasil yang sama pula dengan penelitian ini dimana primer InvA tersebut spesifik Salmonella. Hasil tersebut ditunjukkan dengan
dapat teramplifikasinyamenghasilkan uji positif pada berbagai subspesies dan serovar Salmonella dengan strain yang berbeda tetapi tidak dapat mengamplifikasimenghasilkan uji negatif pada jenis
mikroba selain Salmonella seperti Escherichia coli, Bacillus cereus, Yersinia intermedia, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila,
dan Staphylococcus aureus.
F. Kuantifikasi Salmonella Typhimurium pada Sampel Pangan Susu UHT
